miRNA 遗传多态性影响畜禽复杂性状的研究进展

余乃祥，谢新科，昌小龙，麻骏武

（江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室，江西南昌 330045）

microRNA（miRNA）是一种短链非编码RNA，长度为18～25 nt，在基因的转录后调控中发挥着重要作用。在细胞核内，几百或者数千碱基长度的初级miRNA（pri-miRNA），经Drosha 酶（RNA III 家族核酸内切酶）切割成60～70 个核苷酸长度的miRNA 前体（pre-miRNA），具有特殊茎环（stem-loop）结构的miRNA 前体会被运输至细胞质中，由Dicer 酶（核酸内切酶）加工产生18～25 个核苷酸长度的成熟单链miRNA，而在成熟miRNA 上调控mRNA 的关键结合位置被称为种子区（seed），其长度为6～8 个核苷酸。和其他基因序列一样，miRNA 序列也会受到许多遗传多态性的影响，能够使表型发生变异，如在人类中会导致疾病的更易感性，而在畜禽中则会影响重要的性状。

目前报道的miRNA 遗传多态性主要是单核苷酸多态性（SNPs），有文献将这些SNPs 分成2 组（图1），即影响miRNA 加工过程和成熟miRNA 表达水平的初级miRNA 及miRNA 前体相关SNPs；影响miRNA 识别靶序列或miRNA 靶序列复合物形成的miRNA 种子区SNPs。近年来国内外已有多篇综述报道了miRNA 遗传多态性影响人类疾病相关的研究进展，但是miRNA 遗传多态性影响畜禽复杂性状寥寥无几。因此，本文就miRNA 遗传多态性影响畜禽复杂性状的研究进行综述，希望有助于解析畜禽重要复杂性状的形成机理和开发育种分子标记。

图1 miRNA 相关SNPs[6]

1 影响畜禽复杂性状的miRNA 遗传多态性

本文总结了畜禽中miRNA 基因启动子、种子区、前体和初级miRNA 这4 个区域的遗传多态性研究报道，并列出了其中显著影响畜禽动物复杂性状的miRNA 遗传多态性（表1）。表1 列出的miRNA 遗传多态性主要是SNPs，它们显著影响生长胴体、繁殖、疾病免疫、应激、和肉质等畜禽复杂性状。

表1 影响畜禽复杂性状的miRNA 遗传多态性

1.1 发生在miRNA 种子区上的多态性 MiRNA 能够正常识别靶基因并发挥转录后调控的作用，通常依赖其种子序列，而种子区多态性往往会改变靶基因的选择。同时种子区多态性也会影响miRNA 前体二级结构的稳定性，鸡和牛相关研究发现miRNA 前体序列中种子区SNPs 对miRNA 前体二级结构稳定性的影响最高。耿立英等利用济宁百日鸡、琅琊鸡和汶上芦花鸡等6 个鸡群，发现3 个种子区SNPs 在不同鸡群中的基因分布频率存在差异，还发现miR-1644 前体种子区的SNP（rs14076349，T>C）导致miR-1644 前体二级结构稳定性降低，预测丢失15 个原有靶基因及获得9 个新的靶基因。耿立英等还报道了北京油鸡、太行鸡和来航鸡的miR-1658 前体种子区4 个变异位点组成的单倍型GTGG，会改变miR-1658 前体二级结构稳定性及失去4 个预测靶基因。Shi 等也发现固始与安卡杂交F鸡群的miR-1658 前体种子区SNP（rs16681031，C>G）会改变前体二级结构稳定性并与不同周龄体重、4 周龄胸宽、4 周龄体斜长、4 周龄盆骨宽度、8 周龄胸深和12 周龄体斜长显著相关，但其只讨论了该SNP 可能影响靶基因选择，未进一步验证。

少数研究还发现除影响miRNA 前体二级结构稳定性和靶基因选择外，miRNA 种子区多态性还影响成熟miRNA 产量。miR-378 是与调控脂肪生成、肌肉生长和成骨分化等密切相关的调控因子，Chai 等研究发现在荣昌猪和内江猪的miR-378 种子区中存在SNP（rs331295049，A>G）会改变前体miRNA 二级结构，增加成熟miRNA 产量，预测导致86%原有靶基因丢失和711 个新的靶基因增加，抑制miR-378 促进脂质生成的功能。张廷焕等也报道了荣昌猪的miR-378 种子区SNP（A>G）会增加miR-378 前体二级结构稳定性，提高成熟miR-378 表达，与最后肋骨处背膘厚和眼肌面积性状显著相关。成熟miRNA 产量改变可能是种子区多态性改变miRNA 前体二级结构稳定性后，影响了下游的加工过程，最终改变成熟miRNA 产量。

深入研究发现miRNA 种子区多态性之所以能改变靶基因的选择，是因为其影响了miRNA 种子序列对靶基因3'UTR 的识别与结合。Jiang 等鉴别到位于中国荷斯坦牛乳腺炎和乳房构造相关性状的QTLs 上的miR-2899，其种子区SNP（rs109462250，G>A）导致成熟miR-2899 不能识别和结合（Spi-1 protooncogene）基因3'UTR 的2 个原有位点，消除了miR-2899 对表达下调作用，显著影响乳腺炎。

有些研究只分析了miRNA 与畜禽复杂性状的相关性。李秋玲等研究发现中国荷斯坦牛miR-2902 种子区SNP（T>C）和miR-2306 种子区SNP（G>T）都与热应激反应显著相关。在固始与安卡杂交F鸡群体中，Li 等发现miR-1657 种子区的SNP（rs14934924，G>A）与8 周龄体重、12 周龄胫围及胸骨长度、不同周龄的体重、4 周龄骨盆宽度和皮下脂肪厚度显著相关。

以上研究表明miRNA 种子区遗传多态性会改变miRNA 对靶基因的选择，同时也会改变miRNA 前体的二级结构稳定性，而miRNA 前体的二级结构稳定性的改变能够进一步影响成熟miRNA 表达量。

1.2 发生在miRNA 前体上的多态性 miRNA 前体通过单链内碱基配对形成的发卡结构是Dicer 酶进行识别和剪切加工的重要基础，而发卡结构的稳定性则容易受许多遗传多态性的影响。Li等发现miR-1757 前体SNP（rs15505339，G>C）导致miR-1757 前体二级结构自由能减少和稳定性增强，与胴体性状和体尺指数显著相关。Wu等检测到芦花鸡miR-1684a 前体和miR-1434 前体有7 个SNPs 改变预测miRNA 前体二级结构的自由能，并可能在产卵过程中发挥特殊的生理作用。张翔宇等发现绵羊miR-1 前体下游115bp 的SNP（A>G）能使miR-1 前体二级结构发生变化（自由能降低1.5 KJ/mol），可能对miR-1 前体的加工成熟产生重要影响。宋广超等还发现miR-133 前体下游194bp 的SNP（A>G）会使得miR-133 前体二级结构自由能降低3.2 kg/mol，可能影响成熟miR-133 的生物合成。若miRNA 前体发卡结构稳定性发生变化，这有可能影响Dicer 酶对miRNA 前体的识别和剪切加工过程，进而改变成熟miRNA 表达量。

miRNA 前体二级结构（发卡结构）稳定性变化往往伴随着自由能变化，这会导致成熟miRNA 的表达水平发生多方向的变化。在一方面，miRNA 前体自由能的改变会导致成熟miRNA 的产量上升。在固始-安卡鸡杂交F群体中，Wang等研究发现miR-1666 前体SNP（rs14120863，C>G）降低miR-1666 前体二级结构自由能，增加成熟miR-1666 产量并与多种体型指标显著相关。张伟等在巴什拜羊群体中发现miR-486 前体序列存在SNP（G>C）导致前体miR-486 二级结构自由能升高，稳定性降低，并显著提高细胞中miR-486 的表达水平。而在另一方面，自由能的改变会导致成熟miRNA 产量下降。在固始-安卡鸡杂交F群体中，Wang等发现miR-1704 前体SNP（rs14668705，C>G）显著降低miR-1704 前体二级结构自由能和成熟miR-1704 产量，并与体重、胫围、胴体重和半净膛重显著相关。用相同的固始-安卡鸡群体，Li等发现miR-1606 前体的SNP（rs313467992，C>A）导致前体二级结构自由能和腿部肌肉成熟miRNA 表达都减少，并与不同生长期体重、体指数和胴体性状显著相关。龙熙等研究表明荣昌猪新生小猪的miR-182 前体SNP（G>A）在哺乳动物中高度保守，导致前体miR-182二级结构自由能升高和稳定性降低，使成熟miRNA 在皮下脂肪组织的表达量下降。Gao 等报道了苏太猪和梅山猪miR-215 前体第43 碱基存在SNP（C>T）致使成熟miR-215 表达降低，靶基因表达增加，大肠杆菌黏附力上升，改变肠上皮细胞的稳定性和对大肠杆菌的抵抗力。

值得注意的是，miRNA 前体发生的遗传变异除影响其二级结构稳定性外，也可能决定AGO 蛋白选择miRNA 双链中的哪条形成主要的成熟miRNA。2017年，Sun 等发现猪miR-15b 前体的SNP（C>T）突变阻断了初级miRNA 向miRNA 前体的转化，改变了AGO（RISCs 复合物的主要成员）蛋白对miR-15b-3p和miR-15b-5p 间的链选择，阻碍了成熟miR16-1 的生物发生。此外，miRNA 前体上发生的遗传变异也可能不改变miRNA 前体二级结构稳定性。在固始-安卡杂交F鸡群中，王善禾等发现miR-1816 前体上SNP（rs16057773，A>G）虽然与体重及部分体尺性状显著相关但是不改变miRNA 二级结构的稳定性和成熟miR-1816 的表达水平，Li等也发现miR-1596 前体SNP（rs15190357，C>T）虽然与腿部pH、干湿样脂肪含量、腿肌重、胸肌重、腹脂重及部分体尺显著相关但是不改变miR-1596 前体二级结构稳定性。miRNA 前体遗传多态性虽然显著关联表型但却不影响miRNA 前体二级结构稳定性，故它们可能是依赖其它途径而不是通过影响成熟miRNA 表达量来影响表型。

一些研究表明，miRNA 前体SNPs 密度往往低于其侧翼序列，这一现象在鸡、牛、人和鼠等物种间具有普遍性，甚至存在侧翼区域离 miRNA 基因越远，它们的 SNP 密度就越高的可能。例如，耿立英等对鸡471 个miRNA 前体区域SNPs 分析表明miRNA 前体的SNP 数量显著地低于其侧翼区（<0.01）。穆松等在615 个牛miRNA 基因前体区及其侧翼区共检测到159 个SNPs，miRNA 前体区的SNP 密度为0.362个/kb，低于其侧翼区和整个区域的SNP 密度（分别为0.474 个/kb 和0.458 个/kb）。出现miRNA 前体SNPs低于其侧翼序列的现象说明其存在一定的生物学保守性和重要性。

个别研究仅仅分析了miRNA 前体遗传多态性与畜禽复杂性状的相关性，未深入研究。毕圣群等在杏花和隐性白洛克杂交鸡群的miR-let-7b 基因前体区发现SNP（rs71292045，A>G）与胸肌率、腿胸比呈显著相关，SNP（rs71292453，T>C）与胸肉重、腿肉重、腿肌率、胸肌率、腿胸比呈显著相关。

以上研究表明，miRNA 前体遗传多态性会通过改变前体二级结构稳定性来影响成熟miRNA 的生成，但具体机制仍然需要花费更多精力来进行研究。此外，某些遗传多态性也会改变AGO 蛋白对miRNA 的链选择，影响成熟miRNA 生成。有趣的是，个别遗传多态性虽然与复杂性状显著相关，但并不影响miRNA 前体二级结构稳定性。

1.3 发生在初级miRNA 上的多态性 有研究表明若遗传多态性影响初级miRNA 发卡结构（二级结构）的稳定性，则可以改变成熟miRNA 的表达量。Zhang 等利用特克赛尔羊、中国美利奴细毛羊、阿勒泰羊、湖羊和萨福克羊，从16 个初级miRNA 中鉴定出49 个遗传变异，包括41 个SNPs 和8 个缺失/插入，有89.8%的变异会改变二级结构自由能，其中初级miR-133a 的CCC 缺失/插入，导致初级miRNA 二级结构自由能变小，显著改变成熟miR-133a 表达水平，与绵羊产肉性状相关。Wu 等在3 个品种（白隐形洛克鸡、济宁百日鸡和新杨褐鸡）的初级miR-26a-5p 上鉴别到10 个SNPs，它们构成的单倍型改变了初级miRNA 的二级结构自由能，并显著改变成熟miR-26a-5p 的表达量，其中SNP（rs316365438，C>T）与初次产蛋年龄和32 周产蛋总数显著相关。

发生在初级miRNA 上的多态性，可能通过影响初级miRNA 剪切加工成miRNA 前体的过程，最终改变成熟miRNA 的表达量。Hong 等在巴克夏、长白和大白猪中发现初级miR-1 的SNP（g.123485，C>T）和SNP（g.123287，G>A）构成的单倍型TTAA 显著增加初级、前体和成熟miR-1 表达量，与I 型肌纤维数量（=0.016）和IIa 型肌纤维的面积显著相关。Lee 等在巴克夏、长白和大白猪中发现初级miR-206 的SNP（g.75940，G>A）与滴水损失、亮度、背膘厚、IIa 型肌纤维的比例和IIb 型肌纤维面积组成显著相关，而初级miR-133b 的SNP（g.72008，C>T）与pH、肌纤维总数和眼肌面积显著相关，这2 个SNPs 均极显著增加对应miRNA 前体和成熟miRNA 的表达量。Kim 等发现在3 个品种猪（巴克夏、长白和大白）的miR-208b 前体下游105bp 的SNP（g.17104，G>A）增加前体miR-208b（=0.053）和成熟miR-208b（=0.009）的表达量，对I 型和IIb 型肌纤维比例、肌纤维特性和滴水损失有显著影响。

由于Drosha 酶依赖初级miRNA 单链内碱基配对形成的发卡结构识别并剪切初级miRNA，若初级miRNA 遗传多态性影响初级miRNA 的二级结构稳定性，则可能通过干扰Drosha 酶将初级miRNA 加工成miRNA 前体的过程来影响miRNA 前体数量，最终改变成熟miRNA 的产量。目前，初级miRNA 多态性影响成熟miRNA 产量的具体机制仍不清晰，还需更深入的研究。

1.4 发生在miRNA 启动子区的多态性 miRNA 启动子上的多态性通过影响转录因子与miRNA 启动子的结合来调控成熟miRNA 的表达量，最终影响畜禽的复杂性状。Luo 等发现鸡miR-1596 有2 个SNPs，其中位于miR-1596 上游95 bp 的SNP（g.5678784，A>T），可能破坏miR-1596 的TATA 盒（构成真核生物启动子的元件之一）的模体（Motif），导致成熟miR-1596 表达量降低，显著影响剩余采食量（RFI）。Jia 等在鸡的miR-206 启动子区域发现23 个SNPs，其中位于miR-206 前体上游419 bp 的SNP（G>C），破坏了miR-206 上转录因子MyoD 的结合模体，导致成熟miR-206 低表达，显著影响出生重。2020 年，Li等利用白隐形洛克鸡、济宁百日鸡和新杨褐鸡，也发现miR-1b-3p 前体上游区域734 bp（启动子区域）的SNP（rs737028527，G>A）通过改变转录因子Sp1（specificity protein 1）与miR-1b-3p 的启动子结合，影响成熟miR-1b-3p 的丰度，并与鸡开产日龄以及32周和48 周的产蛋数极显著相关。2020 年，Mahmoudi等在Markhoz 山羊（伊朗本地山羊品种）发现4 个SNPs，其中位于miR-9 启动子上的SNP（C>A），可能会阻止HES1、HES2、NRF1 和TCFL5 转录因子（TFs）与启动子结合，降低成熟miR-9 表达量，对产仔数有极显著的正向影响。根据以上研究，可以推测miRNA 启动子遗传多态性可能改变启动子的活性或绑定转录因子的能力，这影响了转录因子调控miRNA 转录的起始，最终导致成熟miRNA 的表达量变化。

2 前沿的研究方向

为探究miRNA 遗传多态性影响miRNA 调控靶基因的效果，需要从转录水平和蛋白水平验证靶基因表达情况，采样多组学方法将是不错的选择。Cardoso等对380 头Nelore 牛在基因组范围进行SNP 填充，并在转录和蛋白水平验证所鉴别的miR-SNPs（miRNA 单核苷酸多态性）对miRNA 与靶基因相互作用的影响效果，在Nelore 牛基因组范围发现，miR-1921 种子区的SNP（rs110817643，C>T）与不同的-6 脂肪酸、多不饱和脂肪酸及多不饱和与饱和脂肪酸的比例显著相关，成熟miR-2419-3p 的SNP（rs43400521，T>C）与C12:0和C18:1 cis-11 脂肪酸显著相关，成熟miR-193a-2 的SNP（rs516857374，A>G）与C18:3ω-6 脂肪酸和-6/-3比例显著相关，这3 个SNPs 分别改变其相应miRNA二级结构。

有研究表明miRNA 基因往往具有较低的多态性，扩大品种和测序样本数量将有助于鉴别miRNA 遗传多态性。2021 年Emilio 等从11 个亚洲家猪品种、9个欧洲家猪品种及亚洲和欧洲野猪共120 头猪的全基因组测序中发现285 个miRNA 基因SNPs，猪miRNA 基因尤其是种子区由于纯化选择存在多态性减少现象，miR-326 前体顶环区域的SNP（rs319154814，G>A）增加肝脏中成熟miRNA 表达并与肝脏基因mRNA 水平（=0.027）和杜洛克猪臀中肌及被最长肌的几种脂肪酸相关性状相关。

CRISPR-Cas9 系统是一种非常高效、快速、简单和廉价的基因编辑技术，利用CRISPR-Cas9 系统在miRNA 中人为引起突变，破坏成熟miRNA 的剪切加工过程或对靶基因的选择特异性来改变miRNA 对靶基因的表达调控，有助于揭示miRNA 遗传多态性影响畜禽复杂性状的分子机制或者培育新的畜禽品种。2020年，Li等利用CRISPR-Cas9 系统在引起肌肉萎缩的小鼠miR-29b 前体生成加工位点引起新突变，有效阻止小鼠肌肉萎缩。

3 miRNA 遗传多态性相关数据库

2010 年，Hiard 等开发了一个覆盖7 种脊椎动物的数据库Patrocles（http://www.patrocles.org/），这个数据库包含许多预测的能够扰乱miRNA 介导的基因调控DNA 序列多态性（DSPs）。2011 年，Schmeier 等开发了数据库dPORE-miRNA（http://cbrc.kaust.edu.sa/dpore），可以用于探索位于人类miRNA 基因的启动子上转录因子绑定位点的SNP 对miRNA 调控的潜在作用。2015 年，Gong 等开发了数据库miRNASNP 2.0（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/miRNASNP2/），数据库主要包含位于miRNA 上、影响miRNA 生成的基因上和miRNA 靶位点上的一些SNPs。2020 年，Liu等开发了数据库miRNASNP 3.0（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/miRNASNP/），该数据库主要包括定位于miRNA 及其靶基因位点上的能影响miRNA 功能和生成的单核苷酸变异（SNVs），这些SNVs 包含SNPs 和疾病关联变异（DRVs）。

4 展望

近年来，越来越多的研究表明miRNA 遗传变异显著影响畜禽的复杂性状形成，目前畜禽动物中miRNA遗传多态性从多到少依次为牛、鸡、猪、马和羊。此外，随着生物信息技术的进步及研究的深入，miRNA 遗传多态性相关数据库的多态性数量不断丰富。尽管越来越多的报道将miRNA 遗传变异与畜禽的复杂性状关联起来，但是大多数仅仅是基于相关性研究，并未针对miRNA 遗传多态性影响复杂性状的形成机制进行清晰全面解析。还需要注意的是，miRNA 遗传多态性及功能仍然有待更多精力投入以深入研究。未来，随着miRNA 遗传多态性研究的不断推进，更加清晰全面地解析其影响畜禽复杂性状的机制将会为畜禽育种研究注入新的思绪。