三七各部位氢氧同位素特征及其与灌溉水关系

李昕悦，梁社往，李冬雪，郭 婷，赵会玉，郭春平，何忠俊

(1.云南农业大学 资源与环境学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201； 3.曲靖市土壤肥料工作站，云南 曲靖 655000；4.玉溪市农田建设与土壤肥料工作站，云南 玉溪 653100)

稳定氢氧同位素技术具有示踪、整合和指示等多项功能，在大气科学、地球化学、植物水循环[1]等方面发挥着巨大优势。在自然界中，生物体内的H、O等同位素组成受生物代谢类型、环境、气候等因素的影响而发生自然分馏效应，从而使不同来源的物质中同位素自然丰度存在差异[2]。这些差异不易受加工条件以及人为因素改变，利用生物体中同位素差异，能够区分其产地[3-4]。近年来，稳定同位素分析技术已在食品产地溯源中成功运用，在牛肉[5]、羊肉[6]、葡萄酒[7]、茶叶[8]、青稞[9]等的产地和真伪鉴别起到了较大作用。对人指甲、头发[10]中稳定氢氧同位素的研究表明，不同城市常住居民头发、指甲与其饮用水中δD、δ18O比率具有显著相关性。王慧文等[11]分析了鸡肉、饲料、和水中的δD，发现鸡肉δD与饮水中的δD呈高度正相关。

三七(Panaxnotoginseng)为五加科人参属植物[12]。以块根、芦头用药，味甘、微苦、性温。主治出血症，跌打损伤，瘀血肿痛。对于脑血管病、心血管病、血栓、血瘀有较好的功效。还具有消肿定痛，改善心肺血液循环、以及提高人体免疫力、改善淋巴循环的功能。芦头在三七地下部分中所占比例小，皂苷含量高，主要用于制药企业提取皂苷组分的原料[14-15]。三七在云药产业中占有及其重要的地位，2015年我国三七种植面积达70万亩，产量超过3.5万吨，种植业产值突破120亿元，全国以三七为主的系列产品产值超过500亿元。“文山三七”第一批通过GAP(国家食品药品监督管理局组织制定和实施的行业管理法规)基地认证，第一个获得国家地理标志成品保护中药材[16]，2016年《文山三七道地药材》行业标准发布实施。2016年云南省批准三七茎叶作为地方特色食品[16]，筋条和须根主要用于药膳[14]。因此，三七各部位产地鉴别均具有重要意义。

三七主产于云南文山州各县，近年来，随着三七连作障碍加重、道地产区租地成本增加和三七需求量的增长，推动了三七价格上涨，三七种植区域已由文山州向周边州市大面积扩展，另外，云南周边的广西白色、贵州兴义、四川西昌等地也有种植。市场上充斥着真假难辨的三七。产地是道地药材形成的一个重要原因[14]，由于道地药材盲目引种导致的质量下降，生产及销售等环节可能存在伪劣药材，增加了中药材安全事故发生的风险。目前中药材产地的判别方法主要依靠形态、理化鉴别及指纹图谱、二维码等技术，其精确度较低，说服力不足[17]。何忠俊等[17-18]发现三七块根δ18O主要受1月平均温、7月最高温、1月最低温、纬度、湿度、年均温、年降水量的影响；块根δ13C受产地的1月最低温、7月平均温、年均温、经度的综合影响。但关于三七各部位稳定氢氧同位素特征、相关性及其与灌溉水的关系研究甚少。因此，本研究对三七各部位稳定氢氧同位素特征及其影响因素进行研究，拟为三七产地溯源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 三七主产区采样调查

采集三七产区三年生春三七整株及灌溉水样品。控制种源一致(即文山种源)，分别采自广西靖西片区4点，云南文山片区15点、云南新拓展片区24点(红河、昆明、曲靖、玉溪、腾冲)。三个片区采样点数根据种植面积确定，广西靖西片区由于三七种植面积小，故采样点小于其余两个片区；云南新拓展片区覆盖5个州市，种植面积大于文山片区，故采样点最多。采样地基本情况列于表1。

表1 采样地基本情况Table 1 Basic situation of sampling site

利用随机多点取样法进行采集，每个样点按地块东、南、西、北、中随机采集三七植株15株。现场测定经纬度、海拔等地理信息。将活体样本带回实验室，用滴加少许洗洁精的自来水洗去泥土，然后用2%的柠檬酸蒸馏水洗去附着的矿质元素，最后用蒸馏水反复冲洗干净。凉去附着的水分，将茎叶、芦头、块根、筋条、须根分开，称鲜重。105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒重，称干重、粉碎过100目筛，备用。

采集样点附近灌溉水约500 mL密封，于4 ℃条件保存备用。

1.2 稳定氢、氧同位素测定

三七各部位及灌溉水稳定氢、氧同位素在中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所稳定同位素实验室进行。

1.2.1三七(各部位)稳定氢、氧同位素测定 称取一定量样品(0.5 mg)放入元素分析仪 (PYRO-cube,德国Elementar 公司)样品盘中，经燃烧炉高温裂解后，样品中的氢元素和氧元素转化为纯净的H2和CO气体后，进入气体同位素质谱仪(Isoprime 100，德国Elementar公司)进行检测。元素分析主要条件：裂解管主要填料为碳玻璃，燃烧炉温度为1 450 ℃，高纯氦气(He，99.999%)作为载气。同位素质谱主要条件：氦气流量为125 mL·min-1，CO阱电流200 μA，H2阱电流400 μA。采用稀释器对CO气体进行稀释，实现两种气体的同时测定。以USGS54、USGS55和USGS56作为标准样对样品进行校正。

稳定氢同位素比率用δD表示，即δ2H，相对标准为V-SMOW(标准平均海洋水)。计算公式为:

δD‰= (R样品/R标准-1) ×1 000

(1)

式中：R=2H/1H[18]。其中R样品为被测样品的同位素比值，R标准为标准品的同位素比值，下同。

1.2.2灌溉水稳定氢、氧同位素测定 用注射器吸取水样2 mL，经直径13 mm、孔径0.45 μL的尼龙66针筒式过滤器过滤后加入微量瓶中，进入元素分析仪，经1 450 ℃高温裂解成H2，进入同位素质谱仪进行检测，控制氦气流量为125 mL·min-1。分析过程中每12个样品穿插一个国际标样IAEACH-7(δDV-SMOW=(-100.3±2)‰)。

稳定氧同位素比率用δ18O表示，δ18O的标准物质为SMOW (标准平均海洋水)。计算公式为:

δ18O‰=(R样品/R标准-1)×1 000

(2)

式中：R=18O/16O[19]。

1.3 数据处理

采用Excle 2010软件进行数据处理，采用SPSS 19.0进行Duncan’s法多重比较分析、相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同产地三七各部位δD、δ18O差异

三个片区三七各部位δD差异列于表2。经Duncan’s法多重比较，三个产区中三七茎叶、筋条、须根δD无显著差异；芦头和块根中δD以广西靖西片区显著高于云南文山片区和云南新拓展片区，而云南文山片区和云南新拓展片区差异不显著。各部位δD值具有显著性差异，总体趋势为芦头、块根、筋条显著高于茎叶和须根。

表2 不同产地间三七各部位δD组成差异分析Table 2 Analysis of the difference in the δD composition of each organ of Panax notoginseng among different producing areas

三个片区三七各部位δ18O差异列于表3。三七茎叶、芦头、块筋条、须根中δ18O均无显著差异；而块根δ18O则以云南新拓展片区显著高于广西靖西片区，云南文山片区与广西靖西片区、云南新拓展片区无显著差异。三个片区各部位δ18O值中，广西靖西片区以块根显著高于芦头和须根，与茎叶、筋条差异不显著；云南文山片区以块根显著高于芦头、茎叶和须根，而与筋条差异不显著，茎叶、芦头显著高于须根；云南新拓展片区中茎叶、芦头、块根、筋条之间无显著差异，但显著高于须根。各部位间δ18O值大小顺序为块根>筋条>茎叶>芦头>须根。

表3 不同产地间三七各部位δ18O组成差异分析Table 3 Difference analysis of δ18O composition of various organs of Panax notoginseng among different producing areas

2.2 三七各部位中稳定氢氧同位素间及其与地理信息的相关性

三七各部位中稳定氢同位素间的相关性分析列于表4。由表4可知，茎叶δD与芦头、须根δD呈显著正相关；芦头δD与块根、筋条、须根δD呈极显著的正相关，与茎叶δD呈显著正相关；须根δD与茎叶、筋条δD呈显著相关，与芦头δD呈极显著的正相关。总体上，仅芦头δD与其余各部位δD均达到极显著和显著的正相关。茎叶δD与经度呈极显著的负相关、与纬度呈极显著的正相关；芦头δD与海拔呈极显著的负相关，筋条δD与经度呈显著的正相关。须根、筋条由于样本不足，仅有21组数据进行相关性分析，所以筋条与经度的相关系数绝对值大于茎叶与经度的相关系数却未达到极显著相关。

表4 三七各部位中稳定氢同位素间的相关性分析Table 4 Correlation analysis of stable hydrogen isotope in various organs of Panax notoginseng

三七各部位中稳定氧同位素间的相关性分析列于表5。由表5结果可知，除块根δ18O与筋条、须根δ18O相关性不显著外，三七各部位间δ18O均呈极显著正相关。三七各部位δ18O与经度呈极显著的负相关，与纬度呈极显著的正相关，与海拔呈显著正相关。

表5 三七各部位中稳定氧同位素间的相关性分析Table 5 Correlation analysis of stable oxygen isotope in various organs of Panax notoginseng

2.3 灌溉水氢氧同位素与经纬度、海拔及三七各部位δD、δ18O关系

不同三七产区灌溉水稳定同位素组成差异列于表6。经Duncan’s法多重比较，灌溉水δD、δ18O变化规律基本相同，以广西靖西片区灌溉水中δD、δ18O显著高于云南文山片区和云南新拓展片区，云南文山片区与云南新拓展片区差异不显著。灌溉水中δD、δ18O之间呈显著正相关关系(r=0.958，P<0.01)。

表6 不同产地间灌溉水同位素组成差异分析Table 6 Analysis of the difference in isotope composition of irrigation water between different producing areas

对灌溉水δD、δ18O与经纬度、海拔相关性研究，结果列于表7。表7结果表明，灌溉水δD、δ18O与经度呈显著的正相关，与纬度呈显著的负相关，与海拔呈极显著的负相关。对灌溉水与各部位氢氧同位素进行相关性分析发现，仅芦头中δD与灌溉水中δD呈显著正相关关系。而其余部位δD、δ18O与灌溉水中δD、δ18O均无显著相关。

表7 灌溉水中δD、δ18O与经纬度、 海拔及三七各部位δD、δ18O相关性分析Table 7 Correlation analysis of δD and δ18O in irrigation water with latitude and longitude altitude and δD and δ18O of various organs of Panax notoginseng

3 讨论

三七分布区地理、气候、土壤、地质背景差异明显。根据本课题组前期研究，目前三七分布区地理范围经度在98.501°～106.470°，纬度在22.942°～25.677°之间，海拔在490～2 319 m，年均温12.9～19.9 ℃、年降水932～1 664 mm、≥10 ℃积温3 125.3～6 688 ℃(根据经纬度和海拔由TCMGIS-1计算得出)，跨越南亚热带、中亚热带、北亚热带、南温带、中温带五个热量带，湿润和半湿润2个水分区[17-19]。三七种植区具有地域范围相对较小，但海拔、气候类型、地质背景、土壤类型差异大的特征。

三个三七产区中茎叶、筋条、须根δD、δ18O无显著差异；芦头和块根中δD以广西靖西片区显著高于云南文山片区和云南新拓展片区，而云南文山片区和云南新拓展片区差异不显著。符合随海拔、纬度增加而降低的规律[20]。而δ18O的变化规律则与δD相反，有随纬度、海拔增加而增加的趋势。以云南新拓展片区显著高于广西靖西片区，云南文山片区与广西靖西片区、云南新拓展片区无显著差异。各部位δD、δ18O值具有显著差异，δD总体趋势为芦头、块根、筋条显著高于茎叶和须根，δ18O值大小顺序为：块根>筋条>茎叶>芦头>须根。由于纤维素合成过程中氧同位素高度富集，使三七主根δ18O由地表水δ18O的负值变为正值[17]，致使其与δD规律相反，掩盖了地表水δ18O的地域性规律。本课题组前期研究表明，三七块根内氧同位素主要受产地温度状况、纬度、湿度、年降水的影响，具有显著的地域特征[17]。

部位间δD、δ18O相关性研究表明，块根δD、δ18O与筋条、须根δD、δ18O相关性均不显著。芦头δD与其余各部位δD均达极显著和显著正相关。茎叶δD与经度呈极显著的负相关、与纬度呈极显著的正相关，芦头δD与海拔呈极显著的负相关，筋条δD与经度呈显著正相关。三七各部位间δ18O均呈极显著正相关。三七各部位δ18O与经度呈极显著的负相关，与纬度呈极显著的正相关，与海拔呈显著正相关。总体上看，除块根与筋条、须根外，三七各部位间δ18O及其与经纬度的相关性均呈极显著相关，与海拔呈显著相关。说明三七各部位δ18O地域特征明显，可以相互预测，均可作为产地溯源指标。而三七各部位δD能否作为溯源指标值得做进一步的探讨。

三七产区地表水具有明显的经度、纬度和高程效应[21]。地表水δD、δ18O与经度呈显著的正相关，与纬度呈显著的负相关，与海拔呈极显著的负相关。灌溉水中δD、δ18O之间呈极显著正相关关系。但仅芦头中δD与灌溉水中δD呈显著正相关关系。而其余部位δD、δ18O与灌溉水中δD、δ18O均无显著相关。孙淑敏等[6]通过对羊肉样品和当地羊饮水中δD进行分析，发现羊肉中δD与饮用水δD呈极显著正相关；郭波莉等[22]发现不同牧区牦牛肉中δD与饮水密切相关，且均有随海拔升高而降低的趋势。由于三七不同部位化学成分、生理生化特征等的不同，加之三七次生代谢产物占有很高的比例，与动物和以初生代谢产物为主的植物对灌溉水δD、δ18O分馏、富集规律可能有所不同，导致不同部位δD、δ18O与灌溉水δD、δ18O关系发生改变。

4 结论

利用元素分析仪-同位素比率质谱仪测定了不同产区春三七各部位及灌溉水氢氧同位素比率，并结合Duncan’s多重比较和相关分析研究了三七各部位氢氧同位素特征及其与经纬度、海拔和灌溉水氢氧同位素的关系。结果表明，三七各部位δD符合随海拔、纬度增加而降低的规律，而δ18O的变化规律则与δD相反。三七各部位δD、δ18O值具有显著差异，变化规律各异。三七各部位δ18O地域特征明显，除块根与筋条、须根之间外，其余部位间可以相互预测，均可作为产地溯源指标。三七产区灌溉水中δD、δ18O之间呈极显著正相关，具有明显的经度、纬度和高程效应，但仅芦头δD与灌溉水δD呈显著正相关。