嵌合体胚胎冻融移植的临床结局

林慧，刘英，文平，胡素熔，段金良

(中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院生殖中心，桂林 541002)

2016年7月，国际胚胎植入前遗传学诊断协会(PGDIS)修改之前所提的胚胎植入前遗传学筛查(PGS)指南，第一次允许选择性移植嵌合体胚胎[1-2]。同时，PGS也更名为胚胎植入前遗传学非整倍体检测(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)。这些变化，至少在某种程度上，是对发表在2015年的两个关于移植“不正常”胚胎后出生健康活产婴儿报告的回应[3-4]。近几年来，国外有部分关于移植嵌合体胚胎、“不正常”胚胎的报道[5-6]，然而关于囊胚滋养外胚层细胞嵌合胚胎移植的结局尚存在争议，有文献报道囊胚滋养外胚层细胞嵌合程度不是预测持续妊娠率和流产率的良好指标[7]。目前，国内几乎无移植嵌合体胚胎的报道，本研究总结我中心近两年来的相关数据，现报道如下。

一、资料与方法

1.研究对象：选取2018年4月至2020年11月于本院生殖中心行PGT-A的患者。这些患者经取卵、授精后将胚胎培养至囊胚期进行滋养层细胞活检，采用基于染色体拷贝数变异的二代测序方法检测。有少部分患者无整倍体胚胎，患者知情同意后选择移植嵌合体胚胎。移植前所有患者(n=14)均经过遗传咨询且签署高通量测序知情同意书以及胚胎解冻知情同意书。

纳入标准：女方高龄(≥38岁)；反复自然流产(≥2次)；反复着床失败；染色体异常(易位、倒位等)，满足以上1条即可。排除标准：子宫解剖结构异常；内分泌疾病；自身免疫性疾病；子宫内膜异位症。

2.囊胚检测及冻融移植：(1)囊胚活检：囊胚评分参考Gardner 评分系统[8]，本中心活检的胚胎均为D5或D6囊胚(3～4期，内细胞团和滋养层评分在B级以上)。当囊胚达到活检标准时，在内细胞团对侧用激光仪在透明带上打孔，将囊胚继续培养 2～4 h。活检时，取外滋养层细胞5～10 个左右，经培养液洗涤后放入事先装有2.5 μl PBS缓冲液的PCR管内，离心后于-20℃冰箱冻存待检。活检后囊胚采用玻璃化冷冻法保存于液氮中。(2)PGT-A检测：采用PicoPLEX方法将待测样本进行单细胞全基因组扩增，按操作步骤进行，放入设定好参数的 PCR 仪中，先裂解细胞，随后经过预扩增，最后经过指数扩增，用Qubit 3.0将扩增后的产物定量；片段选择；构建文库并将构建好的文库纯化后定量；模板制备与富集：测序文库与乳液PCR缓冲液、乳液PCR酶混合液、模板载体溶液构建“油包水” PCR 反应单元；在DA8600 测序平台完成测序工作；采用“遗传学检测分析管理系统”对测序数据进行分析。(3)冻融胚胎移植：采用人工周期的方法准备内膜，子宫内膜厚度≥8 mm时转化内膜，移植日将经PGT-A检测后的可移植的嵌合体胚胎玻璃化解冻，继续培养2 h后移植。

3.妊娠判定及随访：移植后第14天检测血β-HCG，移植后第28天阴道B超探及妊娠囊为临床妊娠。生殖中心随访专职护士通过电话方式对患者进行随访，包括HCG结果、B超情况、羊水穿刺结果及胎儿出生情况等。

4.观察指标：经过高通量测序检测，分析14例嵌合体胚胎的检测结果及解冻移植后的临床妊娠率及流产率。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

5.统计学方法：计数资料采用率(%)进行统计学描述。

二、结果

1.嵌合体胚胎的高通量测序结果：14例嵌合体胚胎涉及1条或2条染色体的嵌合，嵌合的形式为单体、部分片段单体、部分片段三体嵌合，以部分片段单体嵌合为主(表1)。

表1 嵌合体胚胎的高通量测序结果

2.嵌合体胚胎移植后的妊娠结局：14例移植嵌合体胚胎的患者中，有6例临床妊娠。其中2例已分娩，出生婴儿身体健康，外观无异常；有3例已行产前诊断，胎儿染色体正常；1例于孕8周胚胎停育。嵌合体胚胎移植的着床率和临床妊娠率均为42.86%(6/14)，流产率为16.67%(1/6)(表2)。

表2 嵌合体胚胎移植后的妊娠结局

三、讨论

1.胚胎嵌合体：随着生殖遗传学技术的发展，用于PGT-A的技术主要有荧光原位杂交技术(FISH)、微阵列比较基因组杂交(aCGH)、微阵列单核苷酸多态性(aSNP)、定量PCR(qPCR)、二代测序(NGS)等。检测方法不同，嵌合检出率也不同。

随着PGT-A技术的广泛使用，研究发现移植整倍体胚胎可以提高IVF临床妊娠结局[9]。在IVF获得的胚胎中，染色体嵌合较为常见，被认为是一些整倍体胚胎移植后失败的可能原因之一[10]。尽管卵裂期胚胎的嵌合已有报道[11]，但其在囊胚期的发生率尚不明确。研究发现小鼠囊胚期发生嵌合现象可以被自我纠正[12]，尽管这一现象最初并不被PGS/PGT-A组织广泛接受[13]，但是Munné[14]认为这种自我修正增加的可能性在人类胚胎也有发生。如果事实确实如此，那么PGS/PGT-A在囊胚阶段的检测将没有任何意义，因为胚胎在发育阶段的情况并不反映胚胎最终的命运。

人类囊胚期胚胎滋养外胚层嵌合现象仍然是目前研究的热点。单个胚胎多重滋养外胚层活检显示嵌合率至少有50%，最高可达83%[3，15-16]。相同的胚胎，不同实验室及活检部位不同，得到的结果差异也较大[15]。国外一项运用aCGH技术进行胚胎检测的回顾性研究显示，移植嵌合体胚胎与整倍体胚胎相比，临床妊娠率下降(26.9% vs. 40.2%)，但无统计学差异(P=0.127)[17]。Munné等[18]的回顾性研究显示，复杂的嵌合体胚胎与非整倍体嵌合胚胎相比，有更低的继续妊娠率(10% vs. 50%)；而相比于嵌合率小于40%的胚胎，嵌合率为40%～80%的胚胎其继续妊娠率更低(22% vs. 56%)；单体嵌合与三体嵌合之间、整条染色体嵌合与部分片段嵌合之间没有统计学差异(P>0.05)。相对于嵌合体胚胎移植而言，移植整倍体胚胎的植入率更高、流产率更低、继续妊娠率也更高。Spinella等[19]的研究显示，与整倍体囊胚相比，异常细胞嵌合比例大于50%的囊胚其临床妊娠率、着床率和活产率均降低。而另一研究显示，44枚经NGS检测诊断的嵌合体囊胚中，染色体部分非整倍体嵌合比例低的囊胚与整倍体囊胚的妊娠结局无明显差别[20]。在本研究中，嵌合体胚胎移植的临床妊娠率和着床率均为42.86%，流产率为16.67%；在6例妊娠的患者中，有5例为部分片段嵌合，嵌合比例均小于50%，妊娠结局良好；而另1例为18号染色体单体嵌合，嵌合比例大于50%，孕8周胚胎停育。研究结果存在一定差异可能是由于病例数较少造成的。

2.囊胚质量及发育速度与妊娠结局：国内外的研究认为临床妊娠率与囊胚腔扩张程度及内细胞团质量无关，而与滋养外胚层有关[21-22]。孟庆霞等[23]采用多因素Logistic回归分析发现，影响流产率的两个重要因素是内细胞团评分和囊胚发育天数，影响活产率的最重要因素是滋养外胚层评分；国外相关研究[24-25]也证实了这一观点。柴娟等[26]的研究显示，冻融囊胚D5组种植率和临床妊娠率均高于D6组，而早期流产率比D6组低，均有统计学差异(P<0.05)。本研究中移植后妊娠的6例嵌合体囊胚中，5例为D5囊胚、1例为D6囊胚，且5例为4级囊胚，仅1例为3级囊胚，囊胚发育天数及扩张程度与妊娠率有一定关系。

Minasi等[27]的研究显示囊胚内细胞团评分及囊腔扩张程度越高，整倍性囊胚的占比也越高，且D5囊胚有更高的整倍体率。孙健等[28]的研究也表明，PGS周期中D5比D6囊胚整倍体率稍高，但没有显著差异。Munné等[29]研究认为影响胚胎整倍体的因素很多，培养天数与胚胎整倍体率并无关系。Capalbo等[30]的双中心研究显示，形态等级及发育速度不影响整倍体囊胚的种植率，不同质量的整倍体囊胚获得的持续妊娠率没有显著差异，该研究认为有必要对所有可利用的囊胚进行检测。

3.PGT-A技术的局限性：在胚胎发育过程中，囊胚内细胞团组织发育为胎儿，滋养层细胞发育为胎盘及胎膜等附属物。囊胚滋养层细胞活检理论上不影响胎儿发育，所以该方法已成为了主流的活检方法。事实上，内细胞团与滋养层细胞之间、滋养层不同部位的细胞之间可能并不一样，因此胎盘部位的染色体结果并不能完全代表胎儿部分的情况。

活检的细胞数要求5～10个，如果胚胎滋养层细胞质量差，活检的细胞少，检测结果的代表性就越差。另外，目前对于PGT-A，普遍采用低深度测序染色体拷贝数变异的NGS方法，因此低比例嵌合、小片段缺失及重复以及结构异常等不在检测范围内，需要孕中期产前诊断进一步行CNV-seq检测，一旦检测出异常，及时告知患者行遗传咨询。

总之，PGT-A技术并非无所不能。目前绝大多数的研究认为，嵌合体胚胎具有一定的发育潜能，尽管与整倍体胚胎相比，其临床妊娠率较低，但在患者无整倍体胚胎可移植的情况下，经遗传咨询告知相关风险后可选择移植嵌合体胚胎，孕中期行产前诊断。PGDIS 在关于嵌合体胚胎遗传咨询指南中建议：(1)相较于二倍体-三倍体细胞系嵌合胚胎，优先移植二倍体-单倍体细胞系嵌合胚胎；(2)当选择移植二倍体-三倍体细胞系嵌合胚胎时，应根据嵌合的程度以及受累染色体选择最优胚胎，优先考虑移植包括：1，3，4，5，6，8，9，10，11，12，17，19，20，22，X和Y染色体的三体嵌合；与单亲二倍体(14，15号染色体)相关嵌合三体胚胎的优先级较低；与宫内生长迟缓(2，7，16号染色体)相关嵌合三体胚胎的优先级更低；能够存活(13，18，21号染色体)的嵌合三体胚胎优先级最低[31]。本研究的样本量较少，对于子代安全性问题，还需要更大样本的长期追踪随访。