非整倍体结肠癌对顺铂的耐药性研究

2020-03-13张汉卿

实用临床医药杂志 2020年1期

张汉卿, 刘颖, 房晓

(1. 扬州大学医学院, 江苏扬州, 225001; 2. 扬州大学临床医学院, 江苏扬州, 225001)

Boveri T[1]最早在人类肿瘤组织中发现了非整倍体现象，如今非整倍体已被确认为肿瘤细胞的一大基本特征，超过70%的人类肿瘤中都存在非整倍体[2-3]。纺锤体检验点蛋白如MAD2、BUB1B等表达异常、中心粒异常扩增和微管着丝粒动力学改变等都可以导致细胞产生非整倍体[4-6]。临床研究结果[7-8]表明，非整倍体肿瘤患者对化疗药物普遍具有耐药性。顺铂是目前临床上应用最广泛的一种化疗药物，在结肠癌治疗中的疗效肯定[9]。本研究在实验室已具备可通过Tet-on系统诱导MAD2短发夹RNA(shRNA)表达以产生非整倍体的HCT116. △MAD2细胞系的基础上[10]，通过观察顺铂处理整倍体组与非整倍体组结肠癌细胞后生长和凋亡情况，探讨非整倍体结肠癌细胞是否对顺铂具有耐药性，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系、试剂

顺铂购自美国Sigma-Aldrich公司; 人结肠癌细胞系 HCT116由北京蛋白质组研究中心惠赠; DMEM细胞培养基和血清(Gibco, 美国); 青霉素/链霉素双抗溶液(Gibco, 美国); CCK-8 细胞增殖活性检测试剂盒(Vazyme, 中国); GAPDH抗体(Proteintech, 美国); Caspase-3抗体(Cell signaling, 美国); 鼠二抗和兔二抗(ABclonal, 中国); RNA提取试剂盒(Vazyme, 中国); 反转录试剂盒(Thermo, 美国); SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(Vazyme, 中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与细胞模型验证: 结肠癌细胞HCT116. △MAD2培养于含有10%的血清和1%双抗的DMEM完全培养基中，培养条件为37 ℃、5%CO2。等数量细胞分至2个皿，其中细胞经多西环素(Dox)诱导为敲低MAD2表达的为Dox(+)组(非整倍体)，未经Dox处理的为Dox(-)组(整倍体)。Dox处理时间为12 h, 处理当天为第0天，第1天撤药。第6天进行染色体滴定实验，进行拍照并计数出每个细胞中染色体数目。采用Western Blot实验检测2组细胞第3、6天的MAD2表达情况。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活性: 将2组细胞以8.0×105cells/孔的密度铺入96孔板，随后以0、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L的顺铂梯度浓度处理48 h。随后各组细胞中均加入10.0 μL CCK-8溶液，继续培养1 h后，使用酶标仪450 nm波长测量吸光度。同步进行细胞计数实验，顺铂处理浓度为0、5.0 μmol/L。

1.2.3 Western Blot检测蛋白表达水平: 收集0、5.0 μmol/L顺铂处理48 h的Dox(+)组与Dox(-)组细胞(共4组细胞)，并于第8天使用8.0 mol/L尿素裂解液置于冰上裂解细胞后进行超声，以Bradford法定量蛋白浓度。随后以每孔上样量60.0 μg、浓缩胶6.0%、分离胶12.0%的条件进行电泳。使用湿转方法在硝酸纤维膜上进行转膜，转膜条件为80 V、2 h。转膜后以5%脱脂牛奶室温封闭2 h，随后4℃下一抗敷育过夜 (一抗浓度: α-TUBULIN为1∶2 000，Caspase-3为1∶300)。于室温下孵育二抗2 h(二抗稀释浓度为1∶1 000), 使用Vazyme显影液进行显影。

1.2.4 实时荧光定量即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)实验检测细胞凋亡基因表达: 顺铂处理48 h后，使用Vazyme RNA试剂盒进行提取，随后使用Thermo试剂盒两步法进行cDNA反转，最后按照Vazyme说明书进行荧光定量。使用美国ABI公司的Step One Plus实时荧光定量PCR系统检测凋亡相关基因BAX、PUMA、NOXA的mRNA表达情况。

1.3 统计学意义

2 结果

2.1 细胞模型验证

实验室已具备HCT116. △MAD2细胞系，在该细胞系中加入Dox诱导，可表达MAD2 shRNA以干扰纺锤体检验点功能产生非整倍体，而Dox撤药后MAD2恢复表达，而非整倍体则一直存在[10]。使用Dox处理细胞(第0天)12 h后撤药，通过Western Blot实验验证第3天时MAD2蛋白明显敲低，第6天时MAD2蛋白恢复表达，见图1。因此，第6天进行后续实验观察，可以排除MAD2表达对实验观察的干扰。染色体滴定实验表明，Dox(+)组多为非整倍体细胞，而Dox(-)组多为整倍体细胞，见图2。

2.2 非整倍体细胞对顺铂具有耐药性

临床研究[11]发现肿瘤非整倍体比例高的患者预后较差。在细胞中诱导非整倍体产生后，以不同浓度顺铂处理细胞，通过CCK-8实验和细胞计数实验检测发现, Dox(+)组细胞较Dox(-)组细胞对顺铂具有耐药性。见图3、4。

2.3 非整倍体细胞经顺铂处理后凋亡蛋白表达情况

Western Blot实验发现, Dox(+)组细胞的耐药性与其经顺铂处理后凋亡蛋白表达较低有关，见图5。通过qRT-PCR实验进一步验证顺铂处理后Dox(+)组细胞较Dox(-)组细胞凋亡基因PUMA、NOXA、BAX表达显著减少(P<0.05或P<0.01), 见图6。

图1 第3、6天时Dox(+)组与Dox(-)组MAD2表达情况

图2 Dox(-)组与Dox(+)组染色体数目比较

与Dox(-)比较, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01。图3 CCK-8实验检测顺铂处理后整倍体组与非整倍体组细胞生长活性比较

3 讨论

研究非整倍体对化疗药物的耐药性需要排除遗传背景的干扰。研究[12-14]表明，当纺锤体组装检验点蛋白如MAD2、BUB1和CENPE等异常表达时，会导致姐妹染色单体异常分离形成非整倍体。本课题组通过Tet-on系统短暂敲低MAD2表达以构建一个以非整倍体为主要异常的结肠癌模型，进而使得非整倍体的耐药性研究可以在很大程度上排除遗传背景的干扰。在该结肠癌模型HCT116. △MAD2细胞系中，短时多西环素处理可以诱导细胞产生非整倍体，而未经过多西环素处理的细胞则为整倍体对照。本课题组前期研究[10]表明, Dox(+)组细胞中非整倍体比例较Dox(-)非整倍体细胞比例高9倍以上。

与Dox(-)比较, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01。图4 细胞计数实验检测顺铂处理后整倍体组与非整倍体组细胞数目比较

图5 顺铂处理后Dox(+)组与Dox(-)组细胞凋亡蛋白表达情况

本课题组已对细胞周期特异性药物羟基脲进行试验研究，得出结论非整倍体结肠癌对羟基脲产生耐药性。本研究发现，顺铂作为非特异性细胞周期药物治疗结肠癌细胞时，非整倍体结肠癌对其也具有耐药性。通过CCK-8实验和细胞计数实验可发现, Dox(-)组细胞和Dox(+)组细胞经过顺铂不同浓度梯度处理后, Dox(-)组细胞活性明显下降。Western Blot实验中顺铂处理浓度为0、5.0 μmol/L, 顺铂浓度为5.0 μmol/L时Dox(+)组细胞凋亡蛋白Caspase-3表达较Dox(-)组细胞减少。qRT-PCR实验表明，经顺铂处理后Dox(+)组细胞凋亡基因的表达较Dox(-)组细胞降低，所有实验结果都表明在同浓度顺铂处理时Dox(+)组凋亡指标较Dox(-)组表达较少。