植入前遗传学筛查中不同形态特征的胚胎整倍体率比较

施文浩，张四林，王永博，师娟子

(西北妇女儿童医院生殖中心，陕西 西安 710003)

在自然生殖发育过程中，细胞分裂时期染色体不分离、减数分裂时期染色单体提早分离和染色体丢失引起胚胎染色体异常包括数量和结构异常，数量异常更为常见，主要表现为非整倍体。随着胚胎体外培养研究的深入，发现人类胚胎染色体非整倍体改变在体外受精一胚胎移植中十分常见[1]，是导致胚胎发育异常、着床失败、自发流产、死产等妊娠失败的主要原因[2]。植入前遗传学筛查或诊断(preimplantation genetic screening/diagnosis，PGS/PGD)，在胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低流产率预防出生缺陷。但是PGS的主要缺点是有创，对胚胎后续发育有一定损伤[3]，且远期损害仍不明确[4]。其次检测费用居高不下，对于植入前遗传学筛查的广泛应用造成困难。已有研究发现染色体的整倍体性与胚胎形态学参数存在一定关系[5-6]，因此有必要对预测整倍体的胚胎参数进行研究，在无法进行PGS时提供更有效的预测整倍体胚胎预测方法。本文从西北妇女儿童医院生殖中心PGS活检胚胎染色体结果分析，比较不同发育形态参数胚胎的整倍体和非整倍体率，研究胚胎发育形态学参数与整倍体的相关性。

1资料与方法

1.1研究对象与分组

收集2015年1月1日至2017年4月30日西北妇女儿童医院生殖中心行PGS的常规体外受精-胚胎移植患者，以其所检测胚胎为研究对象。PGS检测在西北妇女儿童医院医学遗传中心完成，采用微阵列比较基因组学技术(BlueGnome 24SureV3)检测。所有进入临床PGS周期的患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1 体外受精胚胎培养及活检

采用常规的促排卵方案，当优势卵泡中有1个直径达到18mm(或者有1/3个卵泡达到18mm)时注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)10 000IU，36～38h后经阴道超声下取卵。取卵后4～6h常规卵胞浆内单精子注射，然后采用序贯培养(vitrolife G-series)胚胎至第3天或第6天，活检时间为受精后第3～6天，卵裂期胚胎在第3天进行卵裂球活检，活检1枚卵裂球送检；囊胚在受精后第5天或第6天活检，活检部分外胚层细胞(5～10个)送检。活检后卵裂期胚胎或囊胚冷冻保存。

1.2.2 卵裂期胚胎和囊胚的评分参数

卵裂期评价为多个参数的综合评价，主要参数为D3天胚胎卵裂球数目、碎片体积比例和不均卵裂球数目。囊胚评价采用Garnder囊胚分级法。先根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分成1～6期，其中3期为完全扩张囊胚，囊胚腔占据整个囊胚；4期为扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；5期为正在孵化的囊胚，囊胚正在从透明带破裂口孵出；6期为孵化出的囊胚,囊胚完全从透明带中脱出。内细胞团和外胚层细胞评分根据细胞数目和紧凑程度评价，A级为细胞数目多，结合紧密；B级为细胞数目较少，结合较松散；C级为细胞数目极少。

1.2.3 PGS检测

活检细胞采用单细胞基因组扩增，采用SurePlex DNA Amplification System 试剂盒进行全基因组扩增，然后通过array-CGH方法(Blue Gnome 24SureV3 package kit)对扩增后的产物进行检测，BlueFuse Multi软件分析并出具PGS报告。

1.3统计学方法

全部数据采用SPSS 6.0统计软件进行统计学处理，率的统计学检验采用χ2检验，等级资料率的检验采用秩和检验，计量资料采用t检验或非参检验，P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1基本数据

PGS共活检348枚胚胎，成功检测322枚胚胎，其中整倍体胚胎数目为123(38.20%)，非整倍体胚胎数目为199(61.80%)，整倍体与非整倍体胚胎的基本数据详见表1。其中PGS指征和男方正常精子形态率的整倍体与非整倍体率比较有统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1整倍体与非整倍体胚胎的基本数据[χ±S,n(%)]

Table 1Basic data of aneuploid and aneuploid embryos[χ±S,n(%)]

项目整倍体(n=123)非整倍体(n=199)t/χ2P母亲年龄(岁)31．37±3．8032．23±5．09-0．930．35男方年龄(岁)33．20±4．6634．21±6．03-1．040．30不孕症类型0．640．43　原发32(26．02)60(30．15)　继发91(73．98)139(69．85)女方基础促卵泡素6．33±2．456．74±2．43-1．430．16PGS指征7．890．02　复发性流产及　反复种植失败62(50．41)105(52．76)　不良孕产史24(19．51)18(9．05)　其他37(30．08)76(38．19)　基础窦卵泡数(个)13．80±5．8812．68±5．531．720．09　正常形态精子率(%)0．03±0．030．02±0．023．210．01

注：嵌合体按非整倍体计算。

2.2卵裂期胚胎参数与胚胎整倍体

卵裂期胚胎评价参数采用D3天胚胎卵裂球数目、碎片体积比例和不均卵裂球数目，比较整倍体与非整倍体间胚胎参数的差异。碎片体积比例在整倍体与非整倍体组中具有统计学差异(P<0.05)，D3天胚胎卵裂球数目和不均卵裂球数目未检验出统计学差异(均P>0.05)，见表2。

表2卵裂期胚胎整倍体与非整倍体的胚胎参数比较(χ±S)

Table 2Comparison of embryo parameters between euploid and aneuploid in cleavage phase (χ±S)

项目整倍体(n=9)非整倍体(n=52)t/ZPD3卵裂球数目8．00±0．877．56±1．36-1．130．26碎片体积比例0．03±0．040．08±0．06-2．600．01不均卵裂球数目0．56±0．530．41±0．540．740．46

注：D3表示活检时间为受精后第3天。

2.3囊胚参数与胚胎整倍体

囊胚评价参数采用活检时间(D4～D5，D6)、囊胚扩张期别(3期，4期，5～6期)、内细胞团形态(A/B，C)、外胚层形态(A/B，C)，比较不同囊胚参数之间整倍体与非整倍体发生率的差异。活检时囊胚扩张期别在整倍体与非整倍体发生率具有统计学差异(P<0.05), 活检时间(D4～D5，D6)、内细胞团形态(A/B，C)和外胚层形态(A/B，C)未检验出统计学差异(均P>0.05)，见表3。

表3囊胚参数的整倍体与非整倍体发生率比较[n(%)]

Table 3 Comparison of the incidence of euploidy and aneuploidy in parameters of blastocyst[n(%)]

项目整倍体(n=114)非整倍体(n=147)χ2P活检时间　D4～D590(78．95)116(78．91)00．99　D624(21．05)31(21．09)活检时的囊胚评分　扩张期别　　3期8(7．02)19(12．93)2．000．01　　4期92(80．70)123(83．67)　　5～6期14(12．28)5(3．40)内细胞团形态　A/B65(57．02)84(57．14)00．98　C49(42．98)63(42．86)外胚层形态　A/B21(18．42)37(25．17)1．690．19　C93(81．58)110(74．83)

注：D4～6表示活检时间为受精后第4～6天；囊胚评分采用Garden评分标准。

3讨论

3.1胚胎发育形态参数与非整倍体的相关性

胚胎染色体的非整倍体与胚胎发育密切相关，2011年Alfarawati研究显示卵裂期胚胎中染色体非整倍体现象普遍存在，而形态评分较差的胚胎，其染色体非整倍体率高于形态较好胚胎。囊胚期胚胎形态也与染色非体整倍体可能相关，2011年关小红研究提示形态学评分较差的废弃胚胎继续培养，其中大部分囊胚发育延缓且形态较差, 活检PGS后染色体异常发生率相对较高。仍有研究提示囊胚内细胞团形态评分对整倍体囊胚移植后的持续临床妊娠率有较高的预测价值[7]。因此胚胎染色体非整倍体体与胚胎形态可能存在一定的相关性。

3.2卵裂期胚胎碎片和活检时囊胚扩张形态与非整倍体

本研究结果显示卵裂期胚胎评价参数中胚胎的碎片体积比例低的胚胎整倍体率较高，检验出统计学差异(P<0.05)，D 3天胚胎卵裂球数目和不均卵裂球数目未检验出统计学差异(P>0.05)。囊胚形态参数中活检时的囊胚扩张期别越高，整倍体率越高。由此推测，早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚发育较快的胚胎整倍体率可能较高。

已有研究提示，卵裂期胚胎碎片比例较高的胚胎，检测后发现染色体异常风险较高，如有研究报道碎片比例>35%的卵裂期胚胎形成的囊胚中，染色体异常率为70%～90%[8]。2001年Ebner发现碎片较高的胚胎移植后妊娠结局较差，胎儿畸形率较高，由此说明胚胎的非整倍体和胚胎碎片比例有一定的相关性，碎片比例较高的胚胎染色体非整倍体风险较高。胚胎染色体异常与胚胎发育关系密切，有研究指出染色体异常可导致不同阶段胚胎发育停滞，延长培养时间后染色体异常的胚胎可能出现发育停滞等，整倍体胚胎可能继续发育，因此囊胚阶段发育较快的囊胚的整倍体概率可能更高[9-10]。

通过我院PGS患者的染色体结果分析得出，卵裂期胚胎评价参数中胚胎的碎片体积比例低的胚胎整倍体率较高,囊胚形态参数中活检时的囊胚扩张期别越高，整倍体率较高。因此早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚发育较快的胚胎整倍体率较高。

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