第7天囊胚培养及其冻融移植的妊娠结局分析

阳娟，于慧君，孙健，黄卫东

(新疆佳音医院，乌鲁木齐 830001)

近年来，随着临床促排卵方案的优化和胚胎培养技术的提高，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率已显著升高。为了降低多胎率、提高着床率，囊胚培养技术在临床上得到越来越多的重视。然而，胚胎从卵裂期发育至囊胚阶段的时间不一致，有的在获卵后第5天形成囊胚，有的要到第6天甚至第7天才形成囊胚[1]。通常，只有在第5天和第6天发育成囊胚才被认为是适合用于移植、冷冻保存或活检的胚胎，而第6天后以较慢的速度发育成的囊胚被常规丢弃。目前研究发现培养第7天形成的囊胚移植后可以获得一定的临床妊娠和活产[2-3]，因此第7天囊胚的冷冻是否具有临床价值仍值得探讨。本中心2018年10～12月将胚胎培养观察时间延长至第7天，并冷冻了第7天的可用囊胚。2019年解冻并移植了8例第7天囊胚，现分析报道如下。

一、临床资料

2018年10～12月我中心行囊胚培养周期137个，形成第7天可用囊胚周期36个，其中仅有第7天可用囊胚周期12个，占总囊胚培养周期的8.76%。第7天有可用囊胚的36个周期，可用囊胚形成率26.89%，第5、6、7天可用囊胚占比分别是21.36%、51.94%、26.70%。本中心囊胚质量评估采用Gardner囊胚评分系统[4]，可用囊胚标准：囊胚形态≥4BB。

2019年解冻并移植了8例第7天囊胚。8例女方患者平均年龄(31.75±3.07)岁。其中，6例因女方输卵管因素行IVF，2例因男方严重弱精子症行卵胞浆内单精子注射(ICSI)。8例中5例曾行鲜胚移植未妊娠或早期流产，3例行全胚冷冻。4例分别解冻移植了2枚第7天囊胚，另外4例分别解冻移植了1枚第7天囊胚。最终3例临床妊娠并足月活产(表1)。

表1 患者一般资料、冻融囊胚移植及临床结局

病例1女方29岁，继发不孕，双侧输卵管粘连、宫腔粘连。新鲜周期采用超长方案促排卵，获卵14枚，其中MⅡ卵11枚，行IVF授精，受精10枚，卵裂10枚，形成优质胚胎5枚。新鲜周期第3天移植2枚优质胚胎，未妊娠。剩余胚胎行囊胚培养，冷冻2枚第7天可用囊胚。冻融移植内膜准备采用促排卵方案，移植日内膜厚度7.0 mm、形态C型，解冻2枚第7天囊胚(5BB、5AB)移植，术后10 d查血HCG阴性。

病例2女方32岁，继发不孕，左侧输卵管缺如(异位妊娠术后)、右侧输卵管阻塞，助孕治疗6次。新鲜周期采用标准长方案促排卵，获卵9枚，其中MⅡ卵8枚，行IVF授精，受精7枚，卵裂7枚，形成优质胚胎3枚。新鲜周期第3天移植2枚优质胚胎，未妊娠。剩余胚胎行囊胚培养，冷冻1枚第6天可用囊胚和2枚第7天可用囊胚。冻融移植内膜准备采用激素替代(HRT)方案，移植日内膜厚度10.0 mm、形态C型，解冻1枚第6天囊胚(4AB)和1枚第7天囊胚(6BA)，其中第6天4AB囊胚解冻后凋亡丢弃，仅移植1枚第7天囊胚，术后10 d查血HCG阳性。术后第26天B超显示宫内活单胎。患者孕41周活产1女婴。

病例3女方38岁，原发不孕，男方严重弱精子症。新鲜周期采用标准长方案促排卵，获卵8枚，其中MⅡ卵5枚，行ICSI授精，受精5枚，卵裂5枚，形成优质胚胎2枚。新鲜周期第3天移植2枚优质胚胎，术后42 d B超未见胎心遂行清宫术。剩余胚胎行囊胚培养，冷冻1枚第7天可用囊胚。冻融移植内膜准备采用自然周期方案，移植日内膜厚度13.0 mm、形态C型，解冻1枚第7天囊胚(5BB)移植，术后10 d查血HCG阴性。

病例4女方30岁，原发不孕，双侧输卵管阻塞，助孕治疗2次。新鲜周期采用超长方案促排卵，获卵20枚，其中MⅡ卵20枚，行IVF授精，受精17枚，卵裂17枚，无第3天优质胚胎。冷冻2枚Ⅱ级胚胎，剩余胚胎行囊胚培养，形成1枚第5天、2枚第6天和2枚第7天可用囊胚。新鲜周期第6天移植2枚可用囊胚，生化妊娠。第1次冻融移植解冻1枚第5天囊胚(5BA)移植，生化妊娠。第2次冻融移植内膜准备采用HRT方案，移植日内膜厚度11.3 mm、形态C型，解冻2枚第7天囊胚(5BB、5BA)移植，术后10 d查血HCG阴性。

病例5女方34岁，原发不孕，双侧输卵管粘连。新鲜周期采用标准长方案促排卵，获卵20枚，其中MⅡ卵19枚，行IVF授精，受精18枚，卵裂17枚，形成优质胚胎7枚。新鲜周期第3天移植2枚优质胚胎，未妊娠。剩余胚胎行囊胚培养，冷冻2枚第7天可用囊胚。冻融移植内膜准备采用促排卵方案，移植日内膜厚度9.5 mm、形态C型，解冻2枚第7天囊胚(5BB、5BB)移植，术后10 d查血HCG阳性，术后第26天 B超显示宫内活单胎。患者孕38周活产1男婴。

病例6女方32岁，原发不孕，双侧输卵管阻塞并积水，助孕治疗1次。新鲜周期采用超长方案促排卵，获卵13枚，其中MⅡ卵13枚，行IVF授精，受精13枚，卵裂13枚，形成优质胚胎8枚。冷冻2枚优质胚胎，剩余胚胎行囊胚培养，形成1枚第6天、3枚第7天可用囊胚。第1次冻融移植解冻1枚第6天囊胚(6BB)移植，未妊娠。第2次冻融移植内膜准备采用HRT方案，移植日内膜厚度9.6 mm、形态C型，解冻1枚第7天囊胚(5AA)移植，术后10 d查血HCG阴性。

病例7女方27岁，继发不孕，男方严重弱精子症，助孕治疗4次。新鲜周期采用超长方案促排卵，获卵25枚，其中MⅡ卵20枚，行ICSI授精，受精16枚，卵裂14枚，无第3天优质胚胎。全部胚胎行囊胚培养，冷冻1枚第7天可用囊胚。冻融移植内膜准备采用HRT方案，移植日内膜厚度9.7 mm、形态C型，解冻1枚第7天囊胚(5BA)移植，术后9 d查血HCG阳性。术后第24天B超显示宫内活单胎。患者孕39周活产1男婴。

病例8与病例6是同一例患者，第3次冻融移植内膜准备采用自然周期方案，移植日内膜厚度10.2 mm、形态C型，解冻2枚第7天囊胚(6BB、4BA)移植，术后10 d查血HCG阴性。

二、讨论

在2013年美国生殖医学协会委员会关于囊胚培养和移植的共识中，建议目前实验室通常在受精后第5天或第6天进行囊胚冷冻保存[5]。另外，欧洲伊斯坦布尔共识也指出“囊胚发育延迟(第7或8天)被认为植入预后不良”[6]，其原因在于普遍认为受精后第7天囊胚为发育过缓胚胎[7]，不仅囊胚形成率低，而且胚胎种植率也较低，因此建议不在第7天进行胚胎评估和冷冻保存。

对于囊胚发育延迟的机制，有研究者认为可能受患者年龄、FSH剂量、促排卵方案、周期数等相关因素的影响，并且单个胚胎形成囊胚的时机很可能是由不同周期因素的组合产生的，包括每个患者体内的聚集效应[8]。这些因素影响配子质量和非整倍性，并可能导致囊胚发育延迟。虽然有证据表明非整倍体是囊胚发育延迟的关键因素[9]，但并不是所有的研究都支持这一点[10-12]。Amir等[13]进行植入前遗传学诊断(PGD)分析发现，与平衡的胚胎相比，携带不平衡易位的胚胎预期会导致植入失败或流产，它们的分裂速度较慢，并且分裂到4细胞期和囊胚形成开始时间有所延迟(P<0.05)。另外还有研究发现第7天的囊胚中有40.5%可能是整倍体[14]，表明发育缓慢并不是在所有情况下均是错误的染色体互补的直接结果。

近年来的临床研究发现，虽然第7天的囊胚比第5天和第6天的囊胚生长慢，但如果可以达到形态的最高水平，其整倍体率与第6天的囊胚相似[15]，并且可能有健康的活产[3，15]。Niu等[16]在一项复苏卵母细胞体外受精研究中发现35.1%的周期在第7天形成囊胚，而3.5%的周期仅在第7天才形成囊胚，第7天形成的囊胚占囊胚总数的15.6%，但第7天高评分的囊胚比例低于第5天或第6天，并且非整倍体率与发育天数没有相关性；与第5或第6天的囊胚移植相比，第7天的囊胚移植后获得相似的临床妊娠、持续妊娠和胚胎着床率。Tiegs等[17]研究显示非整倍体随着囊胚形成时间的延长而增加，但是如果控制了囊胚的形态质量和子宫内膜的异步性，那么与第5天和第6天的整倍体囊胚相比，第7天整倍体胚胎具有相似的着床率。

虽然第7天的囊胚活检数占总囊胚的比例不到2%，但植入前遗传学筛查(PGS)可以是确定哪些第7天囊胚具有高植入潜能的有用工具[18]。研究发现有18.5%的患者在第7天有囊胚，而3.3%的患者只有第7天囊胚，这表明具有先天生长较慢的胚胎的患者可能会受益于额外1天的胚胎培养[2]。对于第6天胚胎可能尚未准备好进行活检或在尝试进行活检后皱缩的情况下，延长培养至第7天也有一定价值。最近Whitney等[19]发现第7天形成的囊胚活检后35.9%为整倍体，此外，该研究还观察到了第7天囊胚移植后获得临床妊娠和活产，第7天活检增加了有正常胚胎移植患者的比例。Du等[20]发现第7天囊胚冻融移植，临床妊娠和活产率均显著低于第5天囊胚，但对婴儿的评估显示，在第5、6和7天冻融囊胚移植组中出生的婴儿，低出生体重、先天畸形和新生儿早期死亡的发生率并无统计学差异。

综上所述，第7天囊胚相比第5、6天囊胚有较高的非整倍体率、较低的临床妊娠率[2，18-19]。但对于没有第5、6天囊胚的患者而言，延迟培养至第7天可增加这部分患者每周期的可用胚胎，在一定程度上减轻患者精神上和经济上的压力，减少患者多次促排卵进行取卵的痛苦，提高累计妊娠率。因此临床上可以个体化考虑将培养延长至第7天的策略。