体外建立灵长类动物滋养层细胞系的研究进展

常晓青，姜良霞，张朴尧，谭 韬

(1.昆明理工大学 灵长类转化医学研究院，非人灵长类生物医学国家重点实验室，云南 昆明 650500；2.云南省人口和计划生育科学技术研究所，云南 昆明 650021；3.北京大学第三医院妇产科，生殖医学中心，生殖内分泌与辅助生殖技术北京市重点实验室，辅助生殖教育部重点实验室，北京 100191)

0 引 言

胎盘在哺乳动物胚胎发育过程中是一个暂时性的器官，对于维持妊娠和胎儿发育至关重要[1-2].胎盘发育紊乱会导致很多妊娠相关疾病的产生，如：妊娠期高血压、胎盘植入性疾病、妊娠期糖尿病和早产等[3-8].胎盘从囊胚期的滋养外胚层发育而来[9]，滋养外胚层由滋养层干细胞(Trophoblast Stem Cells,TSCs)组成，TSCs是胎盘分化细胞的前体细胞，能够分化成所有的滋养层细胞(Trophoblast Cell) 亚型[10].灵长类动物的滋养层细胞主要有三种亚型：细胞滋养层细胞(Cytotrophoblasts,CT)、合胞体滋养层细胞(Syncytiotrophoblasts,ST)和绒毛膜外细胞滋养层细胞(Extravillous Trophoblasts,EVT).其中ST和EVT是由CT分化而来的[11].不同的滋养层细胞亚型负责胎盘不同的功能：ST主要负责母体和胎儿之间的氧气、营养物质和废物交换，ST是由单核细胞融合而成的多核细胞[12]，异常的细胞融合会引发一些妊娠相关疾病，如先兆子痫和胎儿发育不全[13-14].EVT主要负责母体血液的供给，EVT从绒毛的末端侵入蜕膜，重塑母体螺旋动脉，使母体血液能够持续地供应给胎盘[15-18]，较浅或较深的EVT侵袭都会导致一系列的妊娠失败，如胎儿宫内生长受限、反复流产等[19-21].非人灵长类动物及其滋养层细胞模型可以用来研究灵长类动物胎盘发育保守与特异性的机制，因为非人灵长类动物与人类的胎盘绒毛结构、血液屏障、滋养细胞侵入后螺旋动脉重塑模式以及转化方式等都较为相似[22].而小鼠与人类胎盘的结构及功能存在较大差异：小鼠滋养层细胞侵袭程度较浅，而人类滋养层细胞的侵袭较深且较为广泛；小鼠胎盘为迷路结构，人类胎盘为绒毛结构；小鼠子宫动脉的转化依赖于母体因素(子宫NK细胞)，而人类主要依赖于滋养层细胞等[23-24].

由于滋养细胞在动物胎盘发育中至关重要，所以建立灵长类动物滋养层细胞系对灵长类动物胎盘研究具有重要意义.早在1998年就已经成功建立了小鼠滋养层细胞系[25]，在含有成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor 4,FGF4)、NODAL信号通路相关因子、肝素(Heparin)以及胎牛血清(fetal bovine serum)的条件下，可以从小鼠囊胚中分离得到小鼠滋养层干细胞(mouse Trophoblast Stem Cells,mTSCs)[26].但由于小鼠和灵长类胎盘具有较大差异，所以,小鼠滋养层细胞系的方法不完全适用于灵长类动物滋养层干细胞系的建立[27]，建立灵长类动物滋养层细胞模型有助于胎盘发育相关分子机制的研究.目前已有不同实验室建立了不同来源的灵长类滋养层细胞系，本文将围绕灵长类动物滋养层细胞系的建立、研究进展以及滋养层细胞系的应用进行综述.

1 组织来源的灵长类滋养层细胞

1.1 绒毛膜癌来源的滋养层细胞系

1968年，Hertz[28]从人类绒毛膜癌中分离得到了可以连续传代的滋养层BeWo细胞系，这是第一个可以在培养过程中合成激素的人类细胞系.1969年，Kochler等人[29]将BeWo细胞经过连续传代，得到了可以产生人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、人绒毛膜生长素(HCS)和孕酮(progesterone)的JEG细胞系，后续也获得了其他人类绒毛膜癌细胞系，如JAR、ACH-3P 和AC1-M59等细胞系[30-31].绒毛膜癌细胞系有妊娠早期胎盘滋养层细胞的许多结构和功能特征，目前已被广泛用于胎盘体外模型研究[32-34]：BeWo细胞系是目前应用最广泛的绒毛滋养层融合细胞培养模型[35]，可以通过添加毛喉素(Forskolin,cAMP的激活剂)来促进BeWo细胞融合[36]，处理后的细胞会表达参与滋养细胞融合的胶质细胞缺失因子1(Glial Cell Missing 1,GCM_1)[37]；JEG和JAR细胞系经常作为研究绒毛膜癌的细胞模型[38-39].上述细胞系容易在体外进行培养和操作，但它们来源于恶性肿瘤，与正常的滋养层细胞有一定区别，并且部分细胞系长时间传代后不能用于模仿体内滋养层细胞状态.

1.2 胎盘直接分离滋养层细胞及其转化细胞系

1986年，Kliman等人从人足月胎盘中直接分离得到了可在体外培养的单核滋养层细胞，之后Orendi等人[40]使用Percoll梯度法，从妊娠早期胎盘及其绒毛膜组织中分离得到了纯度更高的CT (纯度达80%)，施琼等人[41]使用组织块培养法，也得到了同样纯度的CT.Petroff等人[42]和Serjilus等人[43]使用磁珠和流式分选方法进一步提纯细胞，从胎盘中分离得到了纯度大于97%的CT.直接从胎盘组织分离得到的滋养层细胞系为单核细胞，它们具有成熟及未成熟滋养层细胞的多种结构特征，如：细胞表达KRT7(也称为CK7)、TEAD4、HAND1、ELF5等滋养层细胞标志物和上皮细胞的标志物E-钙黏蛋白(E-Cadherin)，不表达波形蛋白(vimentin)[44-45]，一些单核滋养层细胞会表达分化的ST标志物：hCG、人胎盘催乳素(Human Placental Lactogen,HPL)和妊娠特异性β1糖蛋白(Pregnancy-specific β1-glycoprotein,SP1)，并且会通过单核滋养层细胞的融合形成合胞体细胞[46].但是这些直接从胎盘组织分离而来的细胞生命周期短，难以稳定建系，并会自发地融合，不利于对其进行长期研究.

使用含有SV40大T抗原(simian virus 40 large T antigen)慢病毒的质粒转染从人早期妊娠胎盘中分离的滋养层细胞，可以得到生命周期更长的滋养层转化细胞系HTR-8/SVneo[47]和SGHPL[48].HTR-8/SVneo细胞系表达CK8和CK18，并分泌hCG.SGHPL细胞系则与绒毛外滋养层最为相似，具有原代绒毛膜滋养层细胞系的多种特征：表达KRT7、CD9和HLA-G并分泌hPL[49].HTR-8/SVneo和SGHPL细胞系可以作为体外细胞模型，用于研究早期妊娠期胞外滋养细胞上皮-间充质转化，是目前研究胞外滋养层细胞侵袭、迁移和增殖最常用的细胞系[50-51].HTR-8/SVneo和SGHPL滋养层转化细胞系是滋养层细胞来源的，但两者都为转化状态，仅有滋养层细胞的部分特征，如：HTR-8/SVneo细胞系高表达波形蛋白，但不表达KRT7和E-Cadherin[52]；HTR-8/ SVneo细胞系包含上皮细胞和间充质样细胞，是一类混合细胞群体[53]；SGHPL细胞系的寿命有限(20～25代),所以，滋养层细胞的研究仍然存在一定障碍.

2 灵长类胚胎干细胞诱导来源的滋养层细胞系

2.1 BMP4诱导灵长类胚胎干细胞向滋养层细胞分化

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)具有多能性并且能够分化为机体所有的细胞类型[54].很多研究者都在研究ESCs向滋养层细胞的诱导分化，其中最常见的方法是使用BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4)进行诱导.Xu等人[55]分别将1、10和100 ng/mL的BMP4加入到不同的人类胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)系：H1，H7，H9和H14中，可以诱导hESCs发生剂量依赖性的形态学改变，出现了体积增大并且形态扁平的细胞，与滋养细胞或胎盘发育相关的基因编码转录因子TFAP2、MSX2、SSI3、GATA2和GATA3在经过BMP4处理后的细胞中都显著上调，滋养层标志物如CGA、CGB、MMP9、KRT7、GCM1、HLA-G1和CD9的表达增强，且多能性相关的基因均显著下调.细胞上清液中hCG、雌二醇(estradiol)和孕酮的含量明显升高[55].BMP4的处理时间及使用浓度在不同的研究中具有较大的差异[56].但该方法诱导细胞系的增殖能力有限，表明它们的长期增殖还需要其他的因子的调节[55].并且BMP4不能特异性诱导滋养层谱系的分化，处理的hESCs会同时表达中胚层和内胚层标志物[57].

2.2 Activin/Nodal、FGF和BMP信号共同诱导灵长类胚胎干细胞向滋养层细胞分化

Activin/Nodal和BMP信号可以调节早期hESCs谱系分离，当抑制Activin/Nodal、激活BMP信号时，hESCs可以向滋养层细胞的分化.在培养基中添加BMP4和Activin/Nodal的抑制剂SB431542培养hESCs后，细胞会向滋养层方向分化，具有滋养层细胞的形态和部分标志物的表达[58-59].存在BMP4、添加ActivinA/Nodal的抑制剂SB431542/A83-01和FGF2的抑制剂PD173074时，可以进一步加速hESCs向滋养层细胞的分化.分化的细胞具有部分滋养层细胞的特征：表达KRT7和HLA-G，一些细胞瞬时表达CDX2；中胚层标志物表达减少；细胞具有迁移能力；随着分化时间的增加，培养基中会产生大量的hCG、孕酮、胎盘生长因子(placental growth factor)和HPL[60]，证明了得到的细胞为滋养层细胞样细胞.

但是关于使用BMP4诱导hESCs向滋养层细胞样细胞分化体系还存在一些争议，如：在相同的培养条件下，Bernardo等人[57]只有4%～8%的细胞表达KRT7，而 Roberts等人[61]几乎所有的细胞都表达KRT7；BMP4诱导的hESCs类似于胚外中胚层；ELF5的启动子在hESCs分化的滋养层细胞样细胞中不能模拟TSCs的低甲基状态[61-62].因为滋养层细胞系的定义不清晰，所以Lee等人[63]在2016年使用人类早期胎盘的原代培养细胞定义了滋养层细胞系的4个标准：(1)HLA-I (human leukocyte antigen class I)的特殊表达：TS和ST不表达HLA-I，EVT表达HLA-C、E和G；(2)使用KRT7作为广谱TS细胞的标志物，TFAP2C和GATA3作为单核TS细胞的标志物；(3)ELF5启动子低甲基化；(4)C19MC miRNAs的高表达[63].通过抑制ActivinA/Nodal和FGF2，添加BMP4来诱导hESCs分化的滋养层细胞样细胞并不完全符合以上4个标准，所以hESCs虽然可以分化为具备部分滋养层细胞特征的细胞，但相关研究还需要进一步探索.

2.3 灵长类naïve胚胎干细胞向滋养层细胞的分化

小鼠ESCs可划分为naïve和primed两种状态.Naïve状态的ESCs具有与胚胎植入前上胚层(epiblast,EPI)细胞相似的特征，而primed状态的ESCs则与胚胎植入后的EPI类似，目前已经获得了具有naïve状态的灵长类ESCs[64-65].最近有研究证明可以将naïve hESCs转化为人类滋养层干细胞(hTSCs)：Guo等人[66]通过抑制ERK/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Nodal信号通路，可以高效地将naïve hESCs转化为hTSCs，该hTSCs表达胎盘TSCs相关的标志物：KRT7、ITGA6、HAVCR1和GATA3等，还可将其诱导为CGB+/SDC+ST以及HLA-G+EVT.而primed hESCs则失去了该潜能，仅会向羊膜方向分化.Io等人[67]也得到了相似的研究结果.Cinkornpumin等人[68]使用Okae等人[69]的hTSCs培养条件(下一部分详述)可将naïve hESCs转化为hTSCs，使用该方法产生的转分化-hTSCs(transdifferentiated-hTSCs)表达胎盘核心基因，并且能够向EVT和ST分化.Dong等人[70]也在与Cinkornpumin等人相同的培养条件下得到了同样的结果，其转录组(scRNA-seq)和染色质可及性(ATAC-seq)分析表明，来自naïve的hTSCs与来自囊胚的hTSCs相似，具有植入后滋养层的特征.以上结果证实了naïve hESCs可以向滋养层细胞进行分化.

3 灵长类胚胎来源的滋养层干细胞系

3.1 人类滋养层干细胞系

上述绒毛膜癌来源和部分hESCs来源的人类滋养层细胞系并未完全符合Lee的4个标准，不能视为真正hTSCs.Genbacev等人[71]从妊娠早期绒毛膜上分离出人类滋养层祖细胞系TPBCs，该细胞系表达OCT4、KRT7和GATA4，使用Matrigel诱导分化，会导致OCT4表达下调，并诱导ST和EVT标志物的表达.但最近的研究发现，这些细胞主要向EVT方向分化，这表明它们更类似于EVT前体细胞，而不是真正的hTSCs.随后，Zdravkovic等人[72]从8细胞期的人类胚胎中获得了类似hTSCs的UCSFB6细胞系.在含有bFGF、FCS和SB431542的培养基中培养后，UCSFB6细胞表达滋养层细胞谱系转录因子TEAD4、CDX2、Gminin、GATA3、ELF5、EBES、GCM1和β-catenin，可以传代数10次并维持未分化状态.UCSFB6细胞在存在Matrigel的条件下，可被诱导为表达KRT7、Integrinα1、HLA-G、VE-cadherin和VCAM1，并具有侵袭性的EVT，也可以将UCSFB6细胞诱导为表达hCG和人胎盘催乳素(CSH1)的多核ST.虽然UCSFB6细胞系表达滋养层标志物，但其尚未被鉴定是否完全符合Lee提出的4个标准.

2018年Okae等人[69]建立了包括TSCT和TSblast的hTSCs.Okae使用从妊娠早期胎盘分离出的CT、EVT和ST进行单细胞转录组分析，发现与WNT(Wingless/Integrated)和EGF(epithelial growth factor)信号转导途径相关的基因在CT中表达升高.WNT和EGF是各种上皮干细胞增殖所必需的，包括皮肤干细胞和肠干细胞[73]，Okae发现在含有CHIR99021(WNT激活剂)、EGF、VPA(HDAC抑制剂)、Y27632(ROCK抑制剂)、TGF-β抑制剂：A83-01和SB431542的培养基中可以长期培养CT.这些具有增殖能力的CT核型正常，能够正常增殖至少5个月，表达滋养层标志物KRT7、GATA3、TFAP2C和TEAD4，并且HLA-ABC表达较弱，这些CT被命名为TSCT[69].在添加了Matrigel、NRG-1和A83-01的培养基中，TSCT会经历上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)，形成HLA-G+ EVT样细胞.添加Forskolin的TSCT会融合形成合胞体，表达ST的标志物，在多次传代后仍维持上述功能.Okae使用相同的培养条件也可从人类囊胚中得到TSblast细胞，与TSCT具有相似的特征.转录组和DNA甲基化谱分析显示TSblast和TSCT与CT类似.此外，小鼠TS细胞自我更新所需的转录因子CDX2、ESRRB和SOX2在人类CT、TSCT和TSblast细胞中的表达较低.TSblast和TSCT细胞中的ELF5的启动子都为低甲基化，并且C19MC miRNAs在CT、TSCT和TSblast细胞中高表达[69,74].因此Okae等人建立的TSCT和TSblast细胞符合Lee的4个金标准，证明了TSCT和TSblast细胞是hTSCs.

3.2 非人灵长类动物滋养层干细胞系

非人灵长类动物与人类亲缘关系相对较近，成熟的非人灵长类动物与人类胎盘的形态、免疫能力和胎盘侵袭行为等都较为相似，在某些情况下，可将人源化的抗体应用于非人灵长类动物的胎盘研究[75].所以，非人类灵长类动物是研究人类胎盘的极好模型，非人灵长类动物滋养细胞干细胞(Non-human primates TSCs)可以作为未来评估灵长类滋养细胞发育和功能的体外平台.2007年，Vandevoort等人[76]从恒河猴囊胚中首次分离出具有滋养层干细胞特征的细胞.将恒河猴囊胚除去透明带后在恒河猴胚胎成纤维细胞(REF)饲养层或无饲养层及生长因子(仅有人类胎盘胶原包被)条件下均可稳定传代培养.该细胞系表达KRT7、CD9、CGB和SSEA1滋养层细胞特征，不表达CDX2，同时会表现出类似于EVT的侵袭行为，但在长期培养或β-雌二醇存在下，细胞会形成合胞体样结构.细胞中还检测到合胞素-2((Syncytin-2)和非经典组织相容性抗原MAMU-AG的表达.合胞素-2在滋养层细胞融合中发挥作用，MAMU-AG为非人类灵长类MHC I类基因[77].虽然该恒河猴细胞系可以分化为多核细胞和侵袭细胞，但它们也表达ICM/ESCs的标志物OCT4以及STB的标志物绒毛膜促性腺激素(CG)，并且未对该细胞系进行诱导分化，因此研究者不能确定这些细胞是否是真正的非人灵长类TSCs.

2020年Schmidt等人[78]和Matsumoto等人[79]分别使用不同的方法得到非人灵长类滋养层干细胞系.Schmidt等人[78]通过分离孕早期和孕中期胎盘绒毛状细胞滋养细胞，使用hTSCs培养基(Okae等人的培养条件)培养，获得了恒河猴TSCs系，该细胞系可以稳定增殖.表达KRT7、GATA3、TEAD4、Tfap2c和TP63，并且可分化为恒河猴ST和EVT细胞.经过分析发现恒河猴TSCs与同样从早期胎盘发育而来的hTSCs相似，包括滋养层转录因子和C19MC miRNAs的表达以及ELF5启动子DNA低甲基化.恒河猴TSCs来源的ST和EVT表现出滋养层细胞特有的分化标志，如ST细胞的CG分泌增加、CGA、CGB的表达，EVT细胞表达Mamu-AG和侵袭性相关的基质金属蛋白酶基因(MMP2).这表明了hTSCs培养条件可以用于恒河猴TSCs培养和体外分化.Tanaka等人[25]使用AFHBY培养基(含Activin A、FGF4、肝素、BMS493和Y27632)，从食蟹猴囊胚中建立了食蟹猴TSCs细胞系(macTSCs).macTSCs表达KRT7、GATA3、Tfap2c、VGLL1和HAND1，具有滋养细胞DNA甲基化状态(ELF5启动子低甲基化)，以及C19MC miRNAs的特异性表达.macTSCs还具有向ST和EVT分化的能力：使用dbcAMP诱导macTSCs向ST和EVT分化，分化的细胞会形成多核细胞ST，表达ST细胞的标志物GCM1、CGA和CGB，并分泌孕酮；也会出现侵袭性EVT样细胞，其MMP2和Mafa-AG蛋白的水平表达增加.在异种嵌合体实验中，macTSCs促进了嵌合囊胚中滋养外胚层(TE)的发育.FGF4信号对维持并促进小鼠TSCs的增殖是必不可少的，在Tanaka的这项研究中，FGF4也促进了macTSCs的增殖，这是第一个被FGF4促进增殖的灵长类滋养层细胞系.因为非人灵长类与人类胎盘的结构较为相似，所以非人灵长类滋养层干细胞系的建立可以为分析人类与非人类灵长类动物胎盘发育的异同提供有价值的体外培养模型.

4 体细胞重编程来源滋养层干细胞系

研究者们希望能够从高度分化的体细胞中建立TSCs，从而得到在基因上与患者匹配的TSCs.在最近的2项研究中，Servick[80]和Liu等人[81]发现OSKM(OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC)重编程系统并不局限于胚胎谱系的生成，在该过程中还存在一个滋养层分支，可以形成滋养层谱系.因此,他们将成人皮肤细胞转化为诱导TSCs(hiTSCs)，该hiTSCs能够稳定增殖到50代以上.使用原代CT与hiTSCs进行全面的对比发现：(1)hiTSCs表达单核滋养细胞的关键基因标志物，并且可以分化为EVT和ST;(2)hiTSCs和hTSCs分化的EVT、ST与原代相同类型细胞的转录谱相似;(3)与成纤维细胞和iPS细胞相比，hiTSCs还具有C19MC miRNAs的高表达;(4)观察到在hiTSCs中ELF5基因的启动子和假定增强子区域有特异的开放染色质可及性，与之前的低甲基化状态结果一致;(5)hiTSCs还具有体内分化的潜能[81].

以上不同方法得到的hTSCs具体对应的是胚胎发育的哪个阶段的滋养层谱系仍未知，所以Petropoulos等人[82]和Zhou等人[83]将hTSCs的转录本与人类围着床期胚胎的单细胞RNA测序数据进行了比较分析.转录谱比较发现：hTSCs与植入后第8～10d胚胎中的滋养层细胞相似，表达LRP2和NR2F2，但不表达CDX2和EVT、ST的标志物；源自hTSCs分化的ST和EVT与胚胎中发现的ST和EVT具有相似的表达谱[84].Mischler等人[85]最近也获得了CDX2+ hTSCs，但是这些细胞还未与人类CT进行比较，尚不明确这些细胞具体对应胚胎滋养层发育的哪一个阶段.成体细胞来源的滋养层干细胞系为获得患者来源的细胞系提供了可能，也进一步扩展了滋养层干细胞系的基础研究和临床应用的可能.

5 滋养层细胞系的应用

5.1 滋养层细胞的嵌合体模型

嵌合体实验是评估干细胞功能的金标准，该方法可以在正常发育组织的背景下测试供体干细胞谱系发育的潜能[86].小鼠ESCs的嵌合体实验表明：小鼠ESCs可以参与小鼠嵌合体胚胎部分谱系的发育，却从未参与滋养层谱系的发育[87].Oda等人[88]将荧光标记的小鼠TSCs注射到囊胚后，发现小鼠TSCs对所有滋养层都有一定的嵌合，但对胚胎组织部分没有嵌合.Rielland等人[89]的研究结果也证明即使经过多次传代，小鼠TSCs仍能嵌合到胎盘和顶叶卵黄囊(parietal yolk sac)的滋养层.以上结果表明小鼠TSCs具有作为干细胞的发育潜力.在非人灵长类滋养层干细胞的嵌合体实验中，也得到了类似的结果：Tanaka等人[25]将GFP-macTSCs注射到小鼠8细胞期的胚胎中并进行体外培养至囊胚时期.GFP-macTSCs参与了30%～40%的小鼠嵌合体胚胎体外发育，所有GFP-macTSC细胞均嵌合到滋养层部分，并不嵌合到内细胞团.但人类嵌合体研究涉及到动物福利、供体细胞来源、宿主物种等伦理问题[90]，不能和小鼠TSCs采用同样的方式进行人类TSCs的嵌合体研究，所以研究者们便从“类器官”方向对人类TSCs的潜能进行进一步的研究.

5.2 胎盘滋养层细胞类器官组织模型

近年来，随着“微型器官”或“类器官”的发展以及“器官芯片”的建立，3D培养系统取得了迅速的进展，3D组织培养比2D组织培养的体内生理环境条件更相似[91].胎盘研究领域也建立了许多胎盘“类器官”的模型.有研究者使用hTSCs建立了可以自我复制的胎盘类器官模型.Turco等人[92]和Sheridan等人[93]从妊娠早期胎盘组织中纯化了细胞滋养层细胞，建立了一种可以长期培养并遗传稳定的胎盘滋养层类器官组织，该类器官组织能够分化成ST和EVT，形成绒毛状结构，具有滋养层细胞特征的4个标准，能够检测到胎盘特异性激素的分泌，并且与正常妊娠早期胎盘的甲基化水平类似.Haider等人[94]也建立了类似的滋养层类器官模型：他们同样使用妊娠早期(6到7周)的胎盘，获得了具有增殖能力的滋养层类器官.这些滋养层类器官结构的外层表达hTSCs的标志物，并且会自发地向结构中心进行细胞融合，从而产生能分泌hCG的ST.全基因组表达谱显示，该胎盘滋养层类器官与新分离的CT以及通过2D体外分化产生的ST相似.胎盘滋养层细胞类器官的三维结构可以部分模拟体内细胞分化和腔隙形成的生理过程[94].它们共同存在的问题是胎盘滋养层细胞类器官组织模型结构的ST都在内部，但在正常发育的胎盘中,ST在细胞滋养层的外部.后续研究可能需要进一步优化滋养层细胞自我更新、特化和分化的培养条件.

最近还开发了几种细胞与生物材料3D共培养的方法来研究滋养细胞功能的模型.Nishiguchi等人[95]首次提出了人类滋养细胞的血管化胎盘屏障模型，该模型在人类滋养层细胞(Human pCTB or BeWo cells)上使用了胶原和层粘连蛋白纳米膜，以模拟基底膜、支持细胞及粘附功能.其细胞之间的通讯连接正常，包括缝隙连接的形成.研究者可以将培养区域划分成多个片段，以研究不同细胞类型之间的相互作用.该模型与妊娠早期人类胎盘的结构及对氧气的反应能力存在相似性，初步证明了滋养细胞和内皮细胞之间存在相互作用.该模型还可以用来阐明细胞信号跨越屏障的机制.Kreuder等人[96]则优化了上述模型，建立了一种新的无滤膜屏障模型.使用BeWo细胞系与生物膜内的原代胎盘成纤维细胞和原代人胎盘内皮细胞(代表人胎盘绒毛的三种细胞成分)共培养.在生物膜上共培养两周后，所有细胞类型均保持其细胞类型特异性标志物的表达.Nichol等人[97]使用3D生物的打印Gel-MA，还开发了一种基于细胞、生长因子和趋化因子，在充满水凝胶的同心环中进行滋养层细胞侵袭的分析方法.该模型具有可以控制其几何形状、力学性能、细胞活力、形态以及密度等优点.不仅能够测量滋养层细胞的侵袭程度，而且能够分析侵袭过程中细胞与细胞的相互作用.Blundell等人[98]则建立了一个多层微流体系统，使人类滋养层细胞和人类胎儿内皮细胞能够与生理上相似的空间排列进行共培养，以模拟人类胎盘屏障的结构，具有部分人类胎盘的生理特征.以上几种3D胎盘研究模型都使用绒毛膜癌滋养层细胞作为类器官模型的材料，但因为绒毛膜癌滋养层细胞是恶性起源，并不能完全反映滋养层细胞生理方面情况，所以胎盘类器官模型仍需改进.

目前研究者们利用不同方法建立了在特定培养条件下生长和分化的胎盘“类器官”模型，这些模型可以用于研究细胞通讯及其对胎盘功能的影响，显著促进了人们对胎盘结构和功能的理解.因此胎盘“类器官”模型将为人类胎盘疾病的研究提供有力的平台.

6 总结与展望

人们对胎盘及胎盘疾病了解甚少，主要原因是缺乏稳定的细胞模型进行胎盘相关疾病的病因和预防治疗研究.灵长类动物滋养层细胞系的建立为灵长类动物胎盘研究提供了一个很好的平台，体细胞来源的滋养层干细胞系使胎盘疾病、调控胎盘发育的相关机制研究更为便捷.灵长类动物滋养层干细胞模型将帮助我们了解人类滋养细胞缺陷发育障碍的疾病机制，例如反复流产、先兆子痫和子宫内生长受限等.除此之外，灵长类动物滋养层干细胞系还可以为胚胎领域提供帮助，如：类胚体研究是目前胚胎研究的一个热门方向，同一来源诱导的滋养层干细胞和胚胎干细胞可以为类胚体的研究提供更好的细胞模型.但目前研究者们只得到了类似于植入后第8～10 d 胚胎中的滋养层细胞系，还需要优化培养方案以得到更早期的细胞系.总之，该研究领域需要进行更多、更深入的研究.