单增李斯特菌对小鼠滋养层细胞炎性体的激活

李文艳，陈滢滢，董子怡，刘婕，肖锋，张宇航

(1.河北大学 基础医学院，河北 保定 071000；2.河北省炎性自身免疫性疾病发病机制及防治重点实验室，河北 保定 071000)

单增李斯特菌(Lisetriamonocytogenes, LM)是一种食源性人兽共患病原菌，在自然界广泛存在，妊娠动物和孕妇严重感染后可引发流产，严重影响畜牧养殖业发展和人类生殖健康[1-2]，但其作用机制尚不清楚.研究显示，LM诱导的小鼠流产与母胎界面炎性体的激活有关[3].胎盘滋养层细胞是母胎界面的一种重要细胞，在成功妊娠过程中发挥着重要作用[4]，并且细胞中有多种炎性体表达[5]，LM是否可激活小鼠滋养层细胞炎性体以及LM诱导的小鼠流产是否和LM激活小鼠滋养层细胞炎性体有关鲜见报道.因此，本实验用野生型LM和溶血素O(listeriolysin O，LLO)缺陷型LM (ΔhlyLM)感染小鼠滋养层细胞，分析LM对小鼠滋养层细胞炎性体的激活和LLO在其中的作用以及炎性体激活对滋养层细胞死亡率的影响，初步明确LM对小鼠滋养层细胞炎性体的激活及其与LM诱导流产的关系，为探讨LM引起流产的机理和临床防治提供科学依据.

1 材料和方法

1.1 菌株和细胞株

小鼠胎盘滋养层细胞系SM9-1和菌株L.monocytogenesEGD (serovar 1/2a)分别由美国堪萨斯大学Joan Hunt教授和日本京都大学Masao Mitsuyama博士惠赠.

1.2 主要试剂

胎牛血清和培养基RPMI-1640购自Gibco BRL公司；重组小鼠白细胞介素(interleukin，IL)-1β、天冬氨酸蛋白水解酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase 1) 抑制剂zYVAD-FMK 和LPS购自Sigma公司.美洲仓鼠抗小鼠IL-1β抗体，生物素标记的兔抗小鼠IL-1β抗体购自eBioscience公司；辣根过氧化物酶HRP标记的IL-1β二抗购自Thermo公司；兔抗鼠半胱氨酸的caspase 1 p10和羊抗兔IgG-AP购自Santa Cruz公司;CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司；鼠源BrdU抗体、驴抗鼠Alexa Fluor594和DAPI购自Abcam公司.

1.3 LM对滋养层细胞感染的免疫荧光检测

将生长良好的小鼠滋养层细胞SM9-1铺于放有cover slip的24孔板中，次日用对数生长期的LM感染细胞1 h，50 μg/mL庆大霉素处理1 h以杀死胞外菌，40 g/L PFA固定30 min，通透液通透15 min，封闭液封闭后，分别与一抗和荧光二抗Alexa Fluor 488在湿盒中孵育，DAPI进行细胞核复染色，封片剂封片，激光共聚焦显微镜观察.

1.4 LM对滋养层细胞炎性体的激活

将生长状态良好的小鼠滋养层细胞接种于6孔板，随机分组，次日，LM感染组分别加入含相应数量LM的V-15培养基，CO2培养箱中培养30 min，吸出菌悬液，加入含庆大霉素的培养基杀菌1 h，弃去培养基，加入新的V-15培养基培养6 h.LPS处理组用LPS(0.5 μg/mL)处理细胞6 h，LM和LPS共处理组中LPS与LM同时处理6 h，LPS和ATP共处理组加入LPS预处理4 h后再加入ATP(5 mmol/L)刺激1 h，收集培养基，离心后取上清液待用，细胞经细胞裂解液在4 ℃摇床过夜裂解，次日离心取上清液待用.

1.5 ELISA检测IL-1β蛋白水平

取收集的细胞培养基，用IL-1β捕获抗体包被96孔板过夜，封闭液37 ℃封闭2 h，每孔加入50 g/L脱脂牛奶稀释的待测样品100 μL，然后依次加入检测抗体、酶标抗体，分别孵育2 h，显色后，采用酶标仪读取450 nm波长的吸光度(A450)，计算IL-1β的浓度.

1.6 Western-blot检测caspase 1水平

取制备的细胞裂解液，100 g/L SDS-PAGE电泳后，在恒流180 mA条件下采用湿转法转膜，然后分别用羊抗鼠caspase 1和羊抗兔IgG-AP抗体进行孵育，底物NBT和BCIP显色，扫描仪扫描杂交谱带.

1.7 非放射性细胞毒性检测试剂盒检测细胞死亡

将生长良好的小鼠滋养层细胞接种于6孔板，随机分为 4 组：空白对照组、LM感染组、LM与zYVAD-FMK共处理组、zYVAD-FMK处理组.空白对照组和LM感染组按照1.4中的方法处理细胞，LM与zYVAD-FMK共处理组中加入zYVAD-FMK(10 μmol/L)12 h后用LM刺激，当细胞培养至所需时间后，按照非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书计算细胞毒性百分比，分析小鼠滋养层细胞的死亡率.

1.8 统计方法

通过SPSS18.0统计软件对数据进行处理.数据间均数差异分析采用t检验方法.

2 结果与分析

2.1 LM对小鼠滋养层细胞的感染和最适感染比的确定

LM感染小鼠滋养层细胞SM9-1后，经庆大霉素处理，用LM荧光抗体对LM进行染色(绿色荧光)，DAPI对细胞核进行染色(蓝色荧光)，激光共聚焦显微镜观察LM的分布，结果显示，视野中可观察到LM的存在，并且LM主要分布在细胞核周围(图1a)，说明LM能够感染进入小鼠滋养层细胞，因为庆大霉素能够杀死细胞外的细菌，只有感染进入细胞内的细菌能够存活.

为分析LM感染能否促进小鼠滋养层细胞IL-1β的表达并确定最适感染复数(multiplicity of infection，MOI)，用不同MOI的LM感染小鼠滋养层细胞，ELISA检测培养基中IL-1β水平.结果显示，感染6 h后，每个感染组与对照组相比，培养基中IL-1β水平明显升高，并且当MOI =50时培养基中IL-1β的水平达到最高(图1b).

*与对照组相比差异显著(P<0.05).图1 LM感染滋养层细胞后的荧光染色(a)和IL-1β的分泌(b)Fig.1 Fluorescence staining (a) and IL-1β secretion (b) of trophoblastic cells infected by LM

2.2 LM对小鼠滋养层细胞炎性体的激活

用LM感染小鼠滋养层细胞SM9-1(MOI=50)6 h后，与空白对照组相比，LM感染组培养基中IL-1β水平明显升高，并且LPS与LM共处理组细胞培养基中IL-1β水平与单独LM处理组相比略有升高，但差异不显著(图2a)，说明LM既可以促进IL-1β前体的产生又可以促进IL-1β的成熟.Western blot结果显示，LM感染组与对照组相比，caspase 1 p10片段水平明显增加(图2b)，进一步表明LM可以激活滋养层细胞炎性体，促进IL-1β前体的成熟和释放.

** 与对照组相比差异极显著(P<0.01).图2 LM感染对小鼠滋养层细胞IL-1β(a)和caspase 1(b)活化的影响Fig.2 Effects of LM infection on the activation of IL-1β (a) and caspase 1 (b) in mouse trophoblastic cells

2.3 LM对小鼠滋养层细胞caspase 1依赖焦亡的诱导

用LM感染小鼠滋养层细胞，CytoTox96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放量，评估细胞焦亡率.结果显示，LM感染6 h后，小鼠滋养层细胞的LDH释放量明显高于对照组，说明细胞已开始发生焦亡，感染12 h后，LDH释放量升高更加明显，说明有较多的细胞发生焦亡，但是加入caspase 1抑制剂zYVAD-FMK的LM感染组，无论是感染6 h还是12 h后，LDH的释放量明显低于没有加zYVAD-FMK的LM感染组，说明LM可通过激活滋养层细胞炎性体诱导细胞焦亡(图3).

** 与对照组相比差异极显著(P<0.01).

2.4 LM激活小鼠滋养层细胞炎性体与LLO的关系

分别用野生型LM和ΔhlyLM感染滋养层细胞SM9-1，检测培养基中IL-1β水平和细胞裂解液中caspase 1 p10水平，结果显示，野生型LM刺激后小鼠滋养层细胞IL-1β水平明显高于对照组和ΔhlyLM感染组(图4a)，同时与对照组和ΔhlyLM感染组相比，LM组caspase 1 p10的产生明显增多(图4b),说明LLO在LM激活小鼠滋养层细胞炎性体中发挥着重要作用.

图4 LLO对小鼠滋养层细胞IL-1β(a)和caspase 1(b)活化的影响Fig.4 Effects of LLO on the activation of IL-1β (a) and caspase 1 (b) in mouse trophoblastic cells

3 讨论

LM感染可致妊娠动物和孕妇流产，严重影响畜牧养殖业和人类生殖健康[1-2]，但其致流产的机制尚不清楚.体内实验已经证实，LM诱导的小鼠流产与母胎界面炎性体的激活有关[3]，本研究在本实验室已有体内实验的基础上[3]，在体外通过分析LM对小鼠滋养层细胞炎性体的激活及其诱导的死亡探讨LM诱导小鼠流产的机制.

在妊娠过程中，胎盘滋养层细胞不仅是成功妊娠的物质基础，还是母胎界面特殊的天然免疫细胞[6]，其中有多种炎性体表达.炎性体是免疫细胞内的一类模式识别受体，通过识别病原相关分子模式和危险信号分子招募和活化caspase 1，激活IL-1β和IL-18前体的成熟[7-8]，在LM感染过程中，炎性体适度的激活对妊娠具有保护作用[9-10]，但过度的激活可导致免疫失衡和组织损伤，诱导妊娠失败[3,5].本文的实验结果显示，LM感染可激活小鼠滋养层细胞炎性体，诱导IL-1β的成熟分泌，异常的IL-1β水平则会改变母胎界面的免疫平衡，导致妊娠失败[11-12]，这可能是LM诱导流产的一个重要因素.

妊娠过程中，胎盘细胞的正常死亡对妊娠的维持具有重要作用，但是胎盘细胞死亡率过高或过低均会导致妊娠失败[13].研究显示，LM诱导的MAPK脱磷酸化使细胞中抗凋亡因子血红素加氧酶-1表达下降引发的胎盘细胞凋亡与LM引发的流产有关[14].caspase 1依赖的焦亡是细胞死亡的另一种方式，关于LM感染后滋养层细胞是否会发生焦亡还未见报道，本文的结果显示，LM可诱导caspase 1依赖的滋养层细胞焦亡，这可能是LM诱导流产的又一重要因素.

LLO是LM的一个重要的毒力因子，在LM感染宿主细胞过程中通过其成孔毒性发挥着重要的作用，另外本文的体内实验已经证实，在LM诱导小鼠流产的过程中，LLO可通过激活巨噬细胞炎性体发挥重要作用[3]，但LLO是否可激活母胎界面的滋养层细胞炎性体还未见报道.本文的结果显示，ΔhlyLM感染的小鼠滋养层细胞分泌的IL-1β和caspase 1 p10水平明显低于野生型LM感染组，说明LLO在LM激活小鼠滋养层细胞炎性体的过程中发挥着重要的作用.

综上，LM诱导的流产可能与滋养层细胞炎性体激活诱导的IL-1β分泌水平增加和细胞焦亡有关，在此过程中LM的毒力因子LLO发挥着重要的作用.