不同位置的滋养层细胞与内细胞团分子核型的关系*

李成龙 ，叶洲杰，杜生荣,

（1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117；2.福建省妇幼保健院 福建医科大学附属医院，福建 福州 350117）

近年来随着科学技术在临床应用中的进步，越来越多的家庭，尤其是有家族遗传病的夫妻开始选择体外受精-胚胎移植技术（in vitro fertilization&embryo transfer，IVF-ET）来避免后代出现先天缺陷的遗传病。随着体外受精-胚胎移植技术的不断发展，对于胚胎基因的分析及质量的评估已经成为胚胎移植前重要的筛选参考。然而目前大部分胚胎移植主要以卵裂球数目、形态、胞浆颗粒、碎片数量等为参考依据，单纯的胚胎形态学评分只能从表观上预测胚胎的发育潜能，无法检测胚胎是否带有异常基因或染色体病等。

据目前国内的数据，辅助生殖临床妊娠率为50%～60%之间，抱婴率只有35%左右，而多数胚胎由于染色体异常导致早期妊娠丢失及流产。胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是目前对体外受精胚胎的染色体结构和基因遗传病检测的常用方法，借助二代测序技术，从细胞分子水平检测胚胎的核型，筛选出优质的胚胎进行移植，可以有效地提高抱婴率。囊胚中主要有内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养层细胞（tropheetoderm cell，TE）。目前，对处于囊胚期的胚胎进行囊胚活检是最常用的方法，囊胚活检主要是收集滋养层细胞，通过对滋养层细胞的基因及染色体分析来检测胚胎是否正常，但是囊胚中的滋养层细胞的分布范围较大，有的靠近内细胞团称为ICM邻侧细胞，有的远离内细胞团称为ICM对侧细胞，不同位置的滋养层细胞分子核型与内细胞团有无相关性？是否会影响胚胎诊断结果？本研究通过对囊胚不同位置的滋养层细胞活检后进行染色体分析，更深入地了解植入前胚胎嵌合的发生，并更精准地服务临床。

1 对象和方法

1.1 对象

收集不适宜移植、评分差的囊胚，且夫妻双方染色体均正常。此项研究患者知情同意并经院伦理委员会同意。

1.2 方法

1.2.1 囊胚滋养层细胞和内细胞团活检

用激光在透明带打个小孔，通过显微操作系统，从不同位置活检囊胚滋养层细胞和内细胞团细胞，活检后的细胞装入PCR管，用于细胞全基因扩增。

1.2.2 细胞裂解

细胞裂解缓冲液（Cell Lysis Buffer）5 μL 与细胞裂解酶（Cell Lysis Enzyme）0.1 μL充分混匀，2.5 μL单细胞悬液加入其中，预热PCR仪，孵育样本。

孵育条件：50 ℃，50 min；80 ℃，10 min；4 ℃，长时间。

1.2.3 MALBAC预扩增

前扩增缓冲液（Pre-Amp Buffer）30 μL和前扩增酶（Pre-Amp Enzyme Mix）1 μL混合均匀，7.5 μL gDNA加入其中，短暂离心，充分混匀。

PCR 反应条件：94 ℃，3 min，1个循环；20 ℃、40 s，30 ℃、40 s，40 ℃、30 s，50 ℃、30 s，60℃、30 s，70℃、4 min，95℃、20 s，58 ℃、10 s，8个循环；4 ℃、长时间。

1.2.4 MALBAC扩增

扩增缓冲液（Amplification Buffer）30 μL和扩增酶（Amp Enzyme Mix）0.8 μL混匀，向37.5μL DNA中加入30 μL MALBAC扩增混合液，离心混匀。

PCR 反应条件：94 ℃、30 s，1个循环；94 ℃、20 s，58 ℃、30 s，72 ℃、3 min，20个循环；4 ℃，长时间。

采用Genomic DNA Clean&Concentrator试剂盒纯化WGA产物，纯化产物-20 ℃保存待用。

1.2.5 段化-连接反应

x μL WGA产物(50 ng)，5X Buffer H 2 μL，Buffer EB( 7.6 μL-x μL)，FL-2酶0.4 μL，反应体系共10 μL，孵育条件：55 ℃，10 min，孵育完毕后加入150 μL Buffer PB终止反应，并加入20 μL Buffer EB至180 μL。

1.2.6 文库扩增

扩增反应体系：片段化-连接产物33.8 μL，5X KAPA2G Robust Buffer A 10 μL，2.5 mM dNTPs 4 μL，Index Primer Mix 2 μL，KAPA2G Robust DNA Polymerase 0.2 μL；扩增反应条件：72 ℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 30 s，62 ℃30 s，72 ℃ 3 min，14个循环；4 ℃，长时间。Qingen纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。

1.2.7 测序数据分析

将细胞中提取后扩增的全基因送亿康基因测序分析。

1.2.8 统计学处理

采用spss25.0软件处理数据。计数资料以例和百分数表示（%）。

2 结果

2.1 采样细胞于滋养层细胞同侧

体外受精的胚胎经过一段时间的培养后进入囊胚期，主要分为内细胞团和滋养层细胞（图1 A），用激光在透明带区打个小洞，显微操作仪在囊胚中不同部位分别吸取细胞，然后进行核型分析。根据分析结果（图1 B，C）可知，滋养层细胞TE1和TE2与内细胞团ICM测序结果一致，为46,XN。

图1 人废弃囊胚不同部位滋养层细胞（邻ICM）测序结果

图2人废弃囊胚不同部位滋养层细胞（邻ICM及对侧）测序结果

2.2 采样与滋养层细胞对侧及邻侧

使用显微操作仪对第二个囊胚上的不同部位吸取细胞（图2 A），分析结果表明，TE2细胞的核型为46，XN -21(mos～30%)，而TE1、TE3以及ICM的核型结果一致为46,XN。

2.3 采样与滋养层细胞随机取

使用同样的方法对第三个胚胎不同部位（图3 A）进行检测分析，分析结果（图3 B）表明TE1的核型为46,XN,+16p(mos～40%)，其余细胞的核型与ICM一致为46,XN。

图3 人废弃囊胚多个位点滋养层细胞（邻ICM及对侧多处）测序结果

2.4 不同部位的滋养层细胞与内细胞团基因水平的一致性汇总

对所有囊胚活检细胞与对应ICM细胞的检测汇总发现，不同位置的滋养层细胞与内细胞团的分子核型存在差异，ICM对侧滋养层细胞20个中，有18个细胞分子核型与内细胞团ICM一致，一致率为90%，而邻侧滋养层细胞28个中，有24个细胞与内细胞团ICM一致，为86%。可见，滋养层细胞的分子核型不完全与内细胞团一致。

表1 囊胚活检细胞基因型与ICM比较

3 讨论

受精卵发育成囊胚过程中，受精卵内的细胞由于分布位置不同，分化成两种细胞，一类是内细胞团（Inner cell mass，ICM），未来发育成完整的个体；另一类是滋养层细胞（Tropheetoderm cell，TE），发育成胎盘。而胚胎植入前遗传学诊断技术的应用，是通过活检滋养层细胞代替内细胞团细胞来检测胚胎染色体是否正常，从而减少对胎儿个体发育的干预。但是由于滋养层细胞存在染色体嵌合现象，判读滋养层细胞异常核型或正常的核型与内细胞团细胞实际的分子核型不相符，误诊率大约4.3%[1]。

如何降低误诊率的发生也是目前国际难解决的问题，本研究检测囊胚滋养层细胞不同位置的分子核型，以期提高胚胎的准确诊断率。活检远离内细胞团或者靠近内细胞团细胞，发现不同位置的分子核型有的与内细胞团细胞不相符，有的相符，因此活检滋养层细胞的位置不能间接提高内细胞团分子核型的诊断准确性。Colls P等人研究卵裂期胚胎嵌合比率，至少两个卵裂球是异常的，染色体的嵌合比率为30%[2]。而Capalbo A等人用FISH技术重新分析内细胞团和滋养层细胞的分子核型，嵌合比率低于卵裂期[3]。因此可以通过卵裂期继续培养囊胚来降低嵌合比率的发生，提高诊断的准确率。但是通过活检不同位置的滋养层细胞，并不能提高囊胚诊断准确率，滋养层细胞分子核型是随机分布的，靠近内细胞团两侧细胞同样有不同的分子核型。赵亮等人研究了人植入前囊胚滋养层细胞的空间表达，极滋养层细胞中306个基因上调而壁滋养层细胞只有75个基因上调，两者基因表达存在差异性[4]。Munne S等人用FISH方法研究嵌合胚胎的发生机制，发现5%的非整倍体嵌合是由于有丝分裂后期延迟[5]。这意味着囊胚滋养层细胞就会出现正常的、单体型的、三体型的分子核型。根据Garrisi J等的分割实验，嵌合体囊胚可以分割成不同的细胞系，即单体细胞系和三体细胞系[6]。由于滋养层细胞活检是随机的，不同位置的滋养层细胞分子核型与内细胞团的分子核型没有一致性，检测结果不能反映胚胎的分子核型，但这样的胚胎在临床上仍有应用价值。Bolton H等人以染色体嵌合老鼠为模型，发现非整倍体细胞通过凋亡模式消失，发育胎盘的细胞系有严重的增殖缺陷现象，但只要有充足的整倍体细胞，嵌合的胚胎仍然具有发育潜能[7]，2015年Greco E等人尝试把无整倍体胚胎的18名患者，移植了嵌合比率为35%～50%的胚胎，结果诞生了6名染色体正常的婴儿[8]，所以本研究认为滋养层细胞的分子核型并不能完全反应内细胞团的分子核型，滋养层没有出现位置效应，在临床实践中，如有嵌合型的胚胎，嵌合比率低，仍然建议移植，增加胚胎的利用率。很多医院还会增加一项产前诊断的检查，通过对羊水中胎儿脱落细胞的收集分析来进一步确定胎儿的发育情况以及基因是否正常。

目前胚胎植入前遗传学诊断筛查技术的应用，可以提高胚胎的种植率、妊娠率，但是对于假阴性和假阳性结果的出现还缺乏有效解决方法，本研究活检不同位置的滋养层细胞，分子核型结果与内细胞团比较未见相关性，因此无法通过筛选滋养层细胞的活检位置，来提高胚胎分子核型诊断的准确性，仍然需要多中心、多个测序平台来提高检测的准确性，更好地服务不孕不育夫妇。