健康女性与子宫内膜异位症患者肠道菌群微生物组学研究

2021-06-05韦雅婧梁炎春杨如玉雷舜天王泽海牛刚

实用医学杂志 2021年10期

韦雅婧梁炎春杨如玉雷舜天王泽海牛刚

1中山大学附属第一医院妇产科（广州510080）；2中山大学中山医学院（广州510089）

子宫内膜异位症（简称“内异症”）是一种慢性炎症性疾病，免疫失衡是异位病灶微环境最重要的特征之一［1-3］，可导致患者疼痛和不孕的发生和加剧［4］。发生深部浸润型子宫内膜异位症（deep infiltrating endometriosis，DIE）时，则会引起腹泻或肠道运动障碍等症状［5］。肠道菌群失调与多种炎症疾病的发生发展相关［6］。已有研究［7-10］证实内异症患者或动物模型的宫颈、阴道和肠道存在菌群失调，但较少研究探究卵巢内异症和DIE 患者的肠道菌群是否存在区别。本研究拟通过对健康女性、卵巢内异症患者及DIE 患者的粪便进行测序、结果分析及功能预测，为下一步探究菌群失调在内异症发展的作用提供证据和研究方向。

1 资料与方法

1.1 临床样本收集经中山大学附属第一医院临床研究伦理委员会批准，期间所有样本均按伦理标准处理。经影像学检查和（或）组织学诊断后，将患有卵巢内异症的患者纳入OE 组（n=14），DIE的患者纳入DIE 组（n= 12），健康女性纳入Control组（n=10）。内异症患者粪便样本于术前收集，健康女性的粪便在月经结束后7 d内收集。纳入标准：（1）18 ～45岁未绝经女性；（2）BMI：18.5 ～24 kg/m2；（3）无肠道疾病家族史；（4）近3 个月无抗生素使用史。排除标准：（1）妊娠期妇女；（2）急性或慢性胃肠道疾病或盆腔炎。

1.2 研究方法提取粪便DNA 后对V3⁃V4 区进行PCR 扩增，纯化扩增片段并构建PE2*300 文库。对原始测序数据进行拼接、聚类及物种分类学注释。

1.3 统计学方法使用R 语言进行α多样性分析（Student′t检验）、主坐标分析（PCoA）、群落组成分析、物种差异分析（Kruskal⁃Wallis 秩和检验，FDR校正）。使用PICRUSt 软件进行功能预测分析。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料OE 组、DIE 组和Control 组的年龄和BMI 差异无统计学意义（P＞0.05），提示以上研究组的资料具有可比性。

2.2 物种组成分析Firmicutes、Bacteroidete、Pro⁃teobacteria 和Actinobacteria 是各组主要组成物种。OE 组以及DIE 组相对丰度＜1%的菌群（归为oth⁃ers）比例增多（图1），其中Desulfobacterota、Verru⁃comicrobiata在两组中均增多。Synergistota在DIE组更高。Fusobacteriota 在OE 组更高（图2）。

图1 各组物种组成（门水平）Fig.1 Microbiome composition among three groups（Phylum）

2.3 多样性比较常用Shannon、Simpson、Chao 和Ace 指数来表示α多样性。4 个指数在OE 组和DIE组均高于Control 组，但差异无统计学意义（图3）。

PCoA 结果可用来反映β多样性。各组样本点的距离相近，表示组间的β多样性差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

图2 群落Heatmap 图（门水平）Fig.2 Heatmap of community in phylum level

图3 组间微生物群落α多样性的比较Fig.3 Comparison of α diversity among three groups

2.4 组间物种差异分析门水平，Firmicutes在DIE组较多；Bacteroidete在Control组最多；Proteobacteria和Actinobacteria 在OE 组最多，均差异无统计学意义。纲水平，Negativicutes 在OE 组最低。属水平，OE 组和DIE 组的Fusicatenibacter显著减少，NK4A214_group显著增多。种水平，OE 组和DIE 组的Fusicatenibacter显著减少；Eubacterium_coprosta⁃noligenes_group显著增高，差异均具有统计学意义（P＜0.05，图5）。

2.5 功能预测分析代谢通路预测结果发现，新陈代谢功能的相对丰度最高（图6）。糖代谢和氨基酸代谢的相对丰度在OE 组最高（表1）。氨基酸的嘌呤代谢相对丰度最高，嘧啶代谢次之（表2）。在代谢通路水平3，ABC转运蛋白在OE组丰度最高（表2），与COG 样本丰度统计的结果一致（图7）。

图4 组间PCoA 矩阵分析Fig.4 PCoA analysis among three groups

3 讨论

对卵巢内异症患者、DIE 患者和健康女性的粪便测序后发现，OE 组和DIE 组的Negativicutes 和Fusicatenibacter显著降低，NK4A214_group和Eubac⁃terium_coprostanoligenes_group显著增高。氨基酸代谢和ABC 转运蛋白功能可能在卵巢内异症的发展中发挥着作用。

3.1 子宫内膜异位症与免疫失衡免疫失衡导致异位病灶局部微环境的改变是内异症疼痛和不孕的重要原因，也是其发展的关键因素［11-13］。免疫失衡可通过信号通路影响病灶新生血管和神经的生成，促进异位病灶的发展［14-15］。抑制相关通路可减少病灶炎症细胞的浸润程度，减轻动物模型的慢性机械疼痛［16］。

图5 菌群组间差异分析Fig.5 Differences of microbiome among three groups

图6 通路水平1 各功能相对丰度分析Fig.6 Relative abundance of various functions in Pathway level 1

表1 代谢通路水平2Tab.1 Pathway level 2 of metabolism

3.2 肠道菌群与子宫内膜异位症肠道菌群可提供屏障功能、预防病原体感染及调节免疫等作用，与人类健康状态或疾病的发生发展密切相关［17-18］。已有研究表明内异症患者及动物模型存在菌群失调。Ⅲ/Ⅳ期内异症患者宫颈的加德纳菌属、肠道埃希菌属和志贺菌属增多［10］。患有内异症的恒河猴肠道乳酸杆菌数量减少，革兰阴性菌显著增加［9］。内异症小鼠肠道菌群放线菌门、厚壁杆菌门的丰度增加；“厚壁杆菌/拟杆菌”的比值（被认为是菌群失调的特征）约为对照组的2 倍［7］。用拟杆菌敏感的甲硝唑处理后的异位病灶，其体积和重量下降，巨噬细胞浸润减少［8］。然而，这些证据仅分析了内异症与健康对照组菌群的差异，暂无不同类型内异症的肠道菌群的比较。卵巢内异症是内异症最常见的一种类型，可不伴有症状［19］。DIE 是内异症中最复杂和严重的一种病理类型，常伴严重痛经和（或）周期性肠道症状［20］。本研究发现，OE 组及DIE 组中丰度显著增高的菌群多为革兰阴性菌。革兰氏阴性菌外膜的脂多糖通常能抵抗并清除病原菌。然而，脂多糖也可引起组织损伤，刺激炎症反应，导致发热、多器官衰竭和死亡［21-23］。OE 组和DIE 组革兰阴性菌的异常增高可能通过脂多糖影响异位病灶的免疫微环境，进而疾病的发展及相关症状的发生。