烟酰胺对紫色红曲菌生长和次级代谢产物合成的影响

张 函，张 楠，朱倩倩，王海蛟，石嘉辰，张 婵，2,*，王成涛,2

(1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；2.北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048)

红曲菌是我国常用的药食两用丝状真菌之一，应用历史已有近千年[1]。红曲菌可产生多种次级代谢产物[2-5]，其中，研究较多的3种次级代谢产物为Monacolin K、红曲色素、桔霉素，均为聚酮类化合物。红曲色素是由多种色素组成的可食用天然色素，着色性能好，广泛应用于食品着色行业[6]。桔霉素是一种真菌毒素，有一定的肾毒性，限制了红曲产品在食品医药领域的工业化应用[7]。

Monacolin K通过竞争性抑制效应降低HMG-CoA还原酶的活性，从而阻碍胆固醇合成[8-9]。Monacolin K可被人体直接利用，应用前景良好[10]。但目前Monacolin K产量低、成本高，实现Monacolin K高产主要通过发酵条件优化、培养基组成优化[11]、诱变育种、基因工程[12]等手段。

烟酰胺是烟酸的酰胺化合物，和烟酸均是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的前驱物[13-14]。Huang等[15]的研究发现，向红曲菌培养基中加入甘油后，通过多组学分析，发现ATP合成酶的表达量增加，泛醌氧化还原酶(NADH)在呼吸链中起重要作用，这些蛋白质协同作用于乙酰CoA的生物合成。

实验室前期利用非靶向代谢组学，分析添加谷氨酸与未添加谷氨酸的发酵液样本第8天的代谢组信息，筛选出与聚酮类化合物相关的差异代谢物共12种，其中10种可能与Monacolin K的合成相关。朱倩倩等[16]通过向红曲菌原发酵培养基中添加精氨酸等10种差异代谢物，发现不同质量分数的烟酰胺对Monacolin K有不同的显著影响，低质量分数具有促进作用，而质量分数过高则表现为抑制作用，添加量为质量分数0.5%时，对Monacolin K产量提高具有较佳效果。本研究通过分析烟酰胺对红曲菌生物量、pH值、菌丝形态、红曲色素含量和Monacolin K含量的影响，进一步研究烟酰胺对与红曲菌Monacolin K合成相关基因表达的影响，从而探究作为差异代谢物的烟酰胺是如何影响红曲菌次级代谢产物的合成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生型紫色红曲菌MonascuspurpureusM1菌株，由北京市食品添加剂工程技术研究中心保存。

PDA培养基、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、豆粕粉、NaNO3、MgSO4·7H2O、蛋白胨、KH2PO4、ZnSO4·7H2O、甘油、0.22 μm滤器、一次性注射器、甲醇(色谱纯)、乙醇(分析纯)等，北京半夏科技发展有限公司；RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；Monacolin K标准品 (纯度≥98%)，Sigma公司。

1.2 仪器与设备

20A型超高效液相色谱仪、SPD-M20A型紫外检测器、UV-2450型紫外- 可见光分光光度计，日本岛津公司；LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；M-pact AX124型分析天平，上海欢奥科技公司；超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；PCR扩增仪，德国Biometra公司；NanoDrop 2000型核酸定量仪，Thermo公司；CFX96型实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；SU8010型扫描电子显微镜，日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1培养基制备

固体培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨3、酵母浸粉4、麦芽浸粉20、琼脂20、KH2PO42、NaNO32、MgSO4·7H2O 1 。

液体种子培养基(g/L)：葡萄糖30、甘油70、豆粕粉15、蛋白胨10、KH2PO42、NaNO32、MgSO4·7H2O 1 。

对照组发酵培养基(g/L) ：甘油90、ZnSO4·7H2O 2、大米粉20、KH2PO42.5、蛋白胨10、NaNO35、MgSO4·7H2O 1。

实验组发酵培养基(g/L)[16]：在对照组发酵培养基的基础上添加质量分数0.5%的烟酰胺。

1.3.2菌种培养

M1菌株在固体培养基上活化2代，取适量菌液接种到种子培养基中，30 ℃、200 r/min培养2 d，按10%的接种量将种子液分别接种到对照组和实验组发酵培养基中，30 ℃、150 r/min培养2 d，25 ℃、150 r/min培养13 d。

分别收集红曲菌第2、5、8、12、15天发酵液，置于2 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心10 min，去上清液，用灭菌超纯水重悬，反复3～4次，最后尽量吸除剩余水分，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3Monacolin K含量测定

取5 mL发酵液，向其中加入15 mL体积分数75%的甲醇，超声波萃取30 min，静置过夜，用注射器吸取1 mL左右的样品，经0.22 μm滤膜处理，打进液相小瓶，留待检测。参照文献[17]，利用HPLC检测发酵液中Monacolin K的含量。

色谱条件：色谱柱InertsilODS-3 C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)，流动相为甲醇和质量分数0.1%磷酸(体积比3∶1)，总流速1 mL/min，检测器为紫外检测器，检测温度30 ℃，检测波长237 nm，进样量10 μL。

1.3.4红曲色素色价测定

取5 mL发酵液，向其中加入15 mL体积分数70%的乙醇，于60 ℃恒温水浴1 h，4 000 r/min离心15 min。用紫外分光光度计测定410、448、505 nm处的吸光度[18]，红曲色素色价(U/mL)计算见式(1)。

红曲色素色价= 吸光度 × 稀释倍数 。

(1)

1.3.5菌丝体生物量和pH值的测定

采用干重法测定菌丝体生物量。取5 mL发酵液用3层纱布过滤，再用蒸馏水洗涤2～3次，拧干水分，在60 ℃烘箱中烘干至恒重,称质量[19]，生物量计算见式(2)。

生物量=w(干物质)/V(发酵液) 。

(2)

式(2)中，生物量，g/L；w(干物质)，g；V(发酵液)，L。

用pH计测定不同发酵液pH值，每个样品重复测定3次，结果以平均值表示。

1.3.6菌丝体形态检测

培养8 d的红曲菌发酵液于12 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入体积分数2.5%戊二醛溶液(0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀释)，吸打混匀，常温静置12 h。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗细胞2次，重悬离心2次，弃上清液。依次用不同体积分数的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、100%)重悬，每种体积分数静置10 min后12 000 r/min离心5 min，弃上清液，每种体积分数重复2次。分别用醋酸异戊酯与乙醇(体积比=1∶1)、纯醋酸异戊酯溶液对细胞进行乙醇置换，在每种溶剂中分别静置10 min后，12 000 r/min离心5 min，弃上清液。最后向离心管中加入体积稍超过样品的六甲基二硅胺。脱脂棉封住管口，置于60 ℃烘箱干燥直至样品成粉末状，送样检测[20]。

1.3.7Monacolin K合成相关基因的转录量测定

从2种发酵培养基中提取第2、5、8、12、15天的红曲菌丝体，并将其贮存在液氮中保存。使用RNAprep纯植物试剂盒从菌丝体中提取总RNA，并用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒合成第一链cDNA。利用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒进行RT-qPCR。根据NCBI网站的红曲菌Monacolin K合成相关基因组序列，选取mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH、mokI(NCBI登录号DQ176595.1)9段基因组以及内参基因GAPDH(NCBI登录号HQ123044.1)进行分析，并由华大基因公司设计合成相应引物，特异性引物参照文献[12]设计。荧光定量PCR反应条件为95 ℃反应15 min之后，以下过程进行40次循环：在95 ℃下变性10 s，在52 ℃下退火20 s，以及在72 ℃下延伸30 s。

用比较阈值周期法计算转录相对丰度，对每个样品进行RT-qPCR，重复测量3次并取平均值。

1.4 数据处理

实验均重复3次，数据利用 Excel 进行计算，采用Origin8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 Monacolin K产量分析

选取第5、8、12、15天的2种培养基中的菌液样品，通过HPLC检测Monacolin K产量，见图1。由图1可知，当添加烟酰胺为质量分数0.5%时，在Monacolin K大量生成的第8 天，实验组较对照组降低28.51%左右，在之后的第12天，实验组较对照组降低17.13%左右；实验组在第15天时生成大量Monacolin K，并与对照组相比表现出优势，Monacolin K产量较对照组提高了31.34%，达到124.23 mg/L。推测在对照组中添加烟酰胺后，可在发酵后期促进紫色红曲菌M1大量生成Monacolin K。烟酰胺在生物体内的氧化还原反应中具有传递氢的作用，与糖酵解有密切关系，糖酵解过程是细胞需氧呼吸的第1步，三羧酸循环是细胞需氧呼吸的第2步[21]。Zhou等[22]通过向红曲菌培养基中加入高氯化铵，对所有理论质谱进行连续窗口采集，并检测蛋白质组图谱的变化，开展生物信息学分析，实验发现发酵过程中高氯化铵促进了糖酵解关键酶的活性，以及脂肪酸的β氧化，并产生了足够的乙酰辅酶A。李颖慧等[20]发现在红曲菌发酵液中添加质量分数0.1%的柠檬酸后，对 Monacolin K产量促进效果最为明显，Monacolin K产量是原始培养基的2.71 倍。柠檬酸是三羧酸循环中的代谢物质，因此可以推测Monacolin K生成与糖酵解、三羧酸循环存在一定联系，烟酰胺可能是通过利用糖酵解产生的乙酰辅酶A，从而大量促进Monacolin K生成 。

图1 烟酰胺对Monacolin K产量的影响Fig.1 Effects of nicotinamide on yield of Monacolin K

2.2 红曲色素色价测定结果

通过紫外- 可见分光光度计分别检测第2、5、8、12、15天的2种培养基中红曲红色素、红曲橙色素和红曲黄色素，结果如图2。3种色素的色价变化总体趋势一致，均表现为先上升再下降的趋势，在第12天时产量达到最高。通过对比实验组和对照组发现，对照组菌株的3种色素产量均高于实验组菌株。红曲色素是红曲菌在次级代谢过程中产生的一种由多种聚酮化合物组成的混合物。Juzlova等[23]认为红曲色素通过聚酮途径合成，且与 Monacolin K同属聚酮类物质，两者的合成途径起始均由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成丁酮后，再进入各自的代谢途径，推断二者存在一定的底物竞争关系。柴诗缘等[18]通过向培养基中添加谷氨酸，发现谷氨酸会增加Monacolin K的产量，但同时降低了红曲色素的产量。相似的，李颖慧等[20]通过添加柠檬酸后，发现Monacolin K产量升高的同时，红曲色素的产量降低。因此推测，红曲菌中添加烟酰胺后，提高了Monacolin K产量的同时，在一定程度降低了红曲色素的产量。

图2 烟酰胺对红曲色素产量的影响Fig.2 Effects of nicotinamide on pigment yield of Monascus

2.3 菌丝体生物量和pH值测定结果

通过比较实验组和对照组菌株在不同阶段的红曲菌菌丝体干质量的差异，研究烟酰胺添加对红曲菌菌丝体干重的影响，结果如图3。在第5天生物量达到最高，5 d后呈现不同下降趋势，实验组菌株和对照组菌株菌丝体生物量变化趋势基本一致，且差异并不明显。

图3 烟酰胺对菌丝体生物量的影响Fig.3 Effects of nicotinamide on biomass of mycelium

通过对pH值的检测，研究烟酰胺添加对红曲菌菌丝体培养基pH值的影响，结果如图4。2种发酵培养基始终为弱酸性培养基，为红曲菌提供了适宜的pH环境。在2～8 d，对照组培养基pH值均比实验组培养基高，第8天后实验组比对照组培养基pH值高。红曲菌最适宜pH值为3.5～5.0[24]，推测在发酵初期，烟酰胺为发酵提供了较好的环境；随着发酵的进行，红曲菌将烟酰胺中NAD还原成NADH，利用了环境中的氢离子，因而pH值逐渐升高，8 d后实验组pH值比对照组pH值略高，但仍低于6，随后pH值趋于稳定。

图4 烟酰胺对培养基pH值的影响Fig.4 Effects of nicotinamide on pH value of media

2.4 菌丝体超微结构观察结果

通过扫描电镜检测实验组和对照组菌株菌丝体的形态差异，结果如图5。对比图5(a)和图5(b)可知，实验组菌株的孢子头与对照组菌株相比，褶皱、凹陷更多，且菌体更加膨大；对比图5(c)和图5(d)可知，实验组菌株的菌丝体褶皱程度明显多于对照组菌株，表面积更大。因此推测，烟酰胺的添加可能通过改变菌丝体形态，使细胞壁与原生质体之间缝隙增加，细胞膜通透性增大[25]，从而使得胞内积累的Monacolin K转移至胞外，提高发酵液中Monacolin K产量。Zhang等[12]通过向红曲菌培养基中添加谷氨酸，最终发现，实验组较对照组菌丝形态表现出更多的褶皱和更大的凹陷，表明菌丝体的通透性可能增强。Lv等[3]研究表明：菌丝直径与红曲黄色素的生物合成高度相关，这些菌体形态的改变在一定程度上可以影响次级代谢产物的产量。因此本研究推测，添加烟酰胺后，通过菌体形态发生改变，进而影响了Monacolin K产量。

图5 烟酰胺对菌丝体形态的影响Fig.5 Effect of nicotinamide on morphology of mycelium

2.5 Monacolin K合成相关基因的转录量分析

通过荧光定量PCR技术检测烟酰胺添加对红曲菌Monacolin K合成相关基因表达量的影响，结果如表1。烟酰胺添加后，在第12天时实验组菌株与对照组菌株相比，mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG和mokH基因的表达量呈现上调现象,其中mokA、mokB、mokE、mokH表达量显著上调，而mokI基因表达量呈现下调现象。

表1 mokA～mokI基因的转录量分析Tab.1 Transcriptional analysis of mokA-mokI genes

Chen等[26]在丛毛红曲菌(M.pilosus)中发现了与土曲霉中Monacolin K合成酶基因簇具有高度同源性的9段基因，命名为mokA～mokI，推测该9段基因为Monacolin K合成酶基因簇，mokA和mokB主要参与聚酮合酶的合成[26]。薛意斌等[27]研究发现：通过在红曲菌培养基中添加甘油，随着甘油浓度的增加，mokB的表达量先升高后降低，当甘油浓度为8%时，mokB的表达量较对照组增加32%，mokB的高表达促进了Monacolin K的积累。Zhang等[28]通过将mokE在紫色红曲菌 M1中进行过表达，最终导致Monacolin K的产生增加89.5%，大大提高了Monacolin K的产量。mokH基因推测其是一种转录因子，Chen等[29]在毛霉中过表达mokH基因，发现mokH转化株中Monacolin K产量是野生型菌株的1.7倍，通过RT-qPCR分析发现，mokH转化子中Monacolin K合成基因的表达高于野生型菌株，这表明mokH对Monacolin K的产生具有积极的调节作用。mokG基因编码HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A)还原酶[30]，而HMG-CoA还原酶对Monacolin K合成有很强的抑制作用。而在本实验中mokG基因表达量呈现上调现象，因此对于基因间的相互作用有待进一步研究。最终转录量结果显示：通过对mokA、mokB、mokE、mokH基因表达量的显著上调以及mokI基因表达量的下调，影响了Monacolin K的合成途径。推测，烟酰胺通过影响与红曲菌Monacolin K合成相关基因的转录量水平，进而影响Monacolin K的产量。

3 结 论

研究通过添加质量分数0.5%的烟酰胺，与对照组中的M1菌株对比，分析烟酰胺对红曲色素色价、Monacolin K产量、菌体形态，以及与红曲菌Monacolin K合成相关基因的转录量水平的影响。研究发现：在对照组中添加适量质量分数的烟酰胺，使Monacolin K的产量提高了31.34%，达到124.23 mg/L。但同时对红曲色素产量有一定程度的抑制作用；烟酰胺对菌丝体生物量与培养基pH值无显著影响。通过扫描电镜对菌丝体进行超微结构观察发现：烟酰胺可能提高了红曲菌菌丝体通透性，加速了Monacolin K分泌到细胞外的过程，细胞质中的Monacolin K含量降低，进而达到Monacolin K积累量增加的效果。通过RT-qPCR对红曲菌Monacolin K合成相关基因的转录量进行测定，发现添加烟酰胺后，mokA～mokH的表达量不同程度上调，但同时mokI的表达量下调，烟酰胺可能是通过调节Monacolin K合成的某些关键基因，进而调控Monacolin K的产量。本研究通过添加外源物质研究影响红曲菌次级代谢产物Monacolin K 产量的因素，以期为进一步探究高产Monacolin K的方法提供理论依据。