磷酸化处理对蚕蛹多肽结合钙能力的影响

王思远，赵梓月，穆利霞，邹宇晓，廖森泰，王卫飞

(广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/广东省农产品加工重点实验室/农业农村部功能食品重点实验室，广东 广州 510610)

目前，市场上的补钙产品主要有以碳酸钙为代表的无机钙和以葡萄糖酸钙、乳酸钙和柠檬酸钙等为代表的有机钙，这些产品普遍存在结构不稳定和生物利用率低等问题[1]。研究发现，一些来自食物中的多肽可与钙、铁、锌等二价金属离子结合形成配位键，所生成的金属螯合物结构稳定、易吸收，从而可促进矿物元素的吸收和利用[2-3]。多肽与钙结合的机制主要有磷酸基团- 钙、羧基- 钙两种模式。酪蛋白磷酸肽(CPPs)是目前为止发现的促钙吸收效果最好的短肽，已作为钙强化剂广泛应用于婴幼儿食品及其他补钙类功能食品中。研究表明，当对CPPs进行脱磷处理后，其结合钙活性基本丧失，充分说明了磷酸基团在与钙结合中的重要作用[4]。

蛋白的化学改性是利用多肽的羧基、氨基、羟基等活性基团发生水解、烷基化、酰化、磷酸化等反应，通过改变蛋白质的结构、电荷、疏水基团等，达到改变蛋白质的功能特性[5]。蛋白化学改性具有反应简单、应用广泛和效果显著等特点。磷酸化修饰被证明是可以提高食品蛋白质功能性质的比较重要和有效的改性修饰技术[6]：如Yu等[7]研究了三聚磷酸钠改性制备磷酸化改性花生分离蛋白，改性后样品的溶解性、乳化活性、起泡性、持水性和吸油性等理化特性均有所改善；Enomoto等[8]通过对α-乳清蛋白进行磷酸化修饰，对脂肪的抗氧化能力和免疫活性等均有提高。

近年来，国内外学者致力于寻找高效、低成本的多肽材料，已从多种食品蛋白，如大豆、南极磷虾、太平洋鳕鱼、乌鳢等[9-12]中制备出金属螯合肽，并发现这些肽类在改善钙等二价矿物元素生物利用度方面具有极大的潜力。本研究团队前期开发了一种蚕蛹多肽结合钙，该产品可溶性好，含钙量高。本研究拟利用磷酸化试剂对蚕蛹多肽进行磷酸化改性，考察磷酸化蚕蛹多肽的结合钙能力与结构变化，并对磷酸化反应的工艺进行优化，希望通过增加磷酸化位点，进一步提高多肽的结合钙能力，为多肽结合钙补钙制剂的开发提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜削丝蚕蛹(两广2号)，广东韶关翁源县真诚意蚕桑专业合作社。

Alcalase酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，诺维信(中国) 生物技术有限公司；石油醚、盐酸、无水乙醇、柠檬酸钠、Na2S、CaCl2、NaCl、Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6，均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；NaOH、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，分析纯，福晨(天津)化学试剂有限公司；络黑T，分析纯，天津市天新精细化工开发中心；KH2PO4，分析纯，广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；CR 22GⅢ型高速冷冻离心机，日本日立公司；FD5508型真空冷冻干燥机，韩国ilshin公司；Nicolet IS5型傅立叶红外光谱仪、EASY-nLC 1000型高效液相色谱仪、Orbitrap Elite型质谱仪，美国Thermo Scientific公司；XL-30-ESEM型扫描电子显微镜，荷兰FEI公司。

1.3 实验方法

1.3.1蚕蛹多肽的制备

取新鲜蚕蛹，沸水漂烫2 min，在60 ℃烘箱中烘干，粉碎过40目筛，加入石油醚脱脂，制得脱脂蚕蛹粉。取一定质量的脱脂蚕蛹粉，加蒸馏水配制成质量分数10%的溶液，再加入Alcalase酶酶解4 h，沸水中灭酶5 min，离心取上清液制得蚕蛹多肽溶液。

1.3.2多肽结合钙复合物的制备

本研究团队前期已确定了多肽结合钙复合物的制备条件[13]，具体工艺如下：

取1.3.1中已经制备的蚕蛹多肽溶液，按肽钙质量比3.4∶1.0加入CaCl2。调节溶液pH值为10，73 ℃反应80 min，加入4倍体积95%乙醇溶液进行沉淀，离心后取沉淀，冷冻干燥后得蚕蛹多肽给合钙复合物。

1.3.3磷酸化改性蚕蛹多肽结合钙复合物的制备

本研究团队前期通过单因素实验，以钙结合量为指标，分别采用反应温度(30、40、50、60 ℃)、反应时间(0.5、1、2、3 h)和pH值(6、7、8、9、10)，考察不同磷酸化反应条件对蚕蛹多肽结合钙含量的影响，确定了多肽磷酸化处理的优化条件为：pH值8，反应温度40 ℃，反应时间1 h。

磷酸化改性蚕蛹多肽结合钙复合物的制备：取1.3.1中蚕蛹多肽溶液，加入适量磷酸化试剂，调节pH值为8，40 ℃恒温水浴反应1 h，按肽钙质量比3.4∶1.0加入CaCl2，调节pH值为10，73 ℃反应80 min，加入4倍体积95%乙醇溶液进行沉淀，离心后取沉淀，冷冻干燥后得磷酸化蚕蛹多肽结合钙复合物。

1.3.4磷酸化试剂对蚕蛹多肽结合钙含量的影响实验

分别采用0.1 mol/L的Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6作为磷酸化试剂，考察不同磷酸化试剂对蚕蛹多肽结合钙含量的影响。

分别采用质量分数为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的NaH2PO4作为磷酸化试剂，考察不同添加量的磷酸化试剂对蚕蛹多肽结合钙含量的影响。

1.3.5钙含量测定

参照GB/T 5009.92—2016 中的EDTA滴定法。

1.3.6磷标准曲线绘制与磷含量测定

准确吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL磷标准使用液，分别置于25 mL容量瓶中。依次加入2 mL钼酸铵溶液(50 g/L)，摇匀静置30 s。加入1 mL亚硫酸钠溶液(200 g/L)、1 mL对苯二酚溶液(5 g/L)后定容、摇匀。静置0.5 h后，在660 nm处测定溶液吸光度，绘制标准曲线(见图1)，回归方程为y=0.004 6x+0.000 2，R2=0.999 5，其中，y为吸光值，x为含磷量。

图1 磷标准曲线Fig.1 Standard curve of phosphorus

1.3.7产品结构表征

蚕蛹多肽分子中含有羧基、羟基、氨基等基团，为研究磷酸化处理后，蚕蛹多肽的结构变化，探索肽钙结合方式，对蚕蛹多肽结合钙复合物和磷酸化蚕蛹多肽结合钙复合物样品进行红外光谱分析和磷酸化修饰的位点检测。

1.3.7.1 红外光谱分析

取磷酸化蚕蛹多肽结合钙复合物样品，在波数为4 000～400 cm-1的范围内进行红外光谱分析。

1.3.7.2 磷酸化位点检测

取蚕蛹多肽结合钙复合物和磷酸化蚕蛹多肽结合钙复合物样品各2 mg，加入500 μL质量分数为0.1%的甲酸溶液，置于振荡器上振荡至两种样品全部溶解。取20 μL 完全溶解的样品，使用100%乙腈活化除盐柱进行洗脱，将洗脱溶液离心浓缩干燥，去除乙腈，真空干燥后取1～2 μg样品上机。用液相色谱仪进行分离，使用自填的 Trap 柱(C18，5 μm，100 μm×2 cm)和分析柱(C18，1.9或2.4 μm，75 μm×20 cm)，流速为200 nL/min。串联质谱检测采用的是数据依赖扫描(data dependent acquisition，DDA)模式。全扫分辨率为60 000 (FWHM)，质荷比范围设定为m/z350～1 600，HCD碎裂模式下，碰撞能量设置35%。

1.3.8扫描电镜分析

取一定量蚕蛹多肽、蚕蛹多肽结合钙复合物和磷酸化蚕蛹多肽结合钙复合物样品，将样品抖落至样盘双面胶上，经过喷金镀膜处理后放入扫描电镜抽真空，施加一定电压后，在放大1 000倍数下获取扫描图像。电镜扫描条件设定为：高压5.00 kV，束流6.9×10-2mA，工作距离8.5 mm。

1.4 数据处理

每个实验重复3次及以上，数据用平均值±标准误差(mean±SD)表示，应用EXCEL软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同磷酸化试剂的改性作用及对蚕蛹多肽结合钙能力的影响

不同磷酸化试剂的磷酸化作用及对肽钙结合的影响，实验结果如表1。表1显示：对照组的磷含量为37.26 mg/g,表明蚕蛹多肽中已含有少量磷酸基团；磷酸化处理后，样品中磷和钙的质量分数显著高于未改性组，说明这些多肽中的某些基团被磷酸化了，且引入的磷酸基团又与钙离子发生了结合；不同于磷酸试剂处理蚕蛹多肽，改性后制得的多肽结合钙样品的钙、磷含量无显著差异，表明这3种试剂对蚕蛹多肽的磷酸化作用相近。从食品安全和成本角度综合考虑，选择NaH2PO4为改性蚕蛹多肽制备肽钙复合物的磷酸化试剂。

表1 不同磷酸化试剂对磷酸化蚕蛹多肽结合钙中的钙与磷含量的影响Tab.1 Effect of different kinds phosphorylation reagents on content of calcium and phosphorus of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-calcium complex mg/g

2.2 磷酸化水平对蚕蛹多肽结合钙能力的影响

采用不同质量分数的NaH2PO4对蚕蛹多肽进行改性，进一步分析制备出的多肽结合钙样品中的钙含量与磷含量，结果如表2。表2显示：随着NaH2PO4浓度不断增加，蚕蛹多肽结合钙中的磷含量不断升高，但钙含量随着磷含量的升高呈先升高后下降的趋势；当采用质量分数为0.50%的NaH2PO4作为磷酸化试剂时，多肽结合钙中磷的质量分数为116.41 mg/g，结合钙质量分数达到最大，为202.32 mg/g。

表2 NaH2PO4添加量对制得的蚕蛹多肽结合钙中的钙与磷含量的影响Tab.2 Effect of different addition of NaH2PO4 on content of calcium and phosphorus of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-caciam complex mg/g

结果表明，多肽磷酸化改性后可提高与钙的结合率，但钙结合能力并不与引入的磷酸基团呈正相关性，适宜程度的磷酸化水平更有利于多肽与钙相结合。本研究结果与相关报道一致，如Jiang等[14]利用胰蛋白酶水解卵黄高磷蛋白后，用碱法脱磷将卵黄磷蛋白磷酸肽(PPPs)处理成17.5%～96.3%不同磷酸化程度的多肽，发现含35%磷酸化的PPPs对增强钙结合能力和抑制不溶性磷酸钙的形成是最有效的。

2.3 磷酸化改性对蚕蛹多肽结构的影响

2.3.1磷酸化位点检测结果

磷酸化位点检测结果见表3。表3显示，蚕蛹多肽结合钙中共鉴定出4个磷酸化位点，改性后，有17种肽段被磷酸化，增加磷酸化位点22个。磷酸化修饰主要发生在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Try)两种氨基酸上，磷酸化试剂能够与 Ser和Try的—OH发生亲核加成反应[15]，使磷酸基团接枝到多肽分子上，多肽再通过磷酸基团与Ca2+结合。

表3 磷酸化蚕蛹多肽结合钙中磷酸化修饰的位点信息Tab.3 Phosphorylation sites of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-calcium complex

2.3.2红外光谱分析结果

图2 不同质量分数的NaH2PO4处理制得的蚕蛹多肽结合钙红外光谱Fig.2 Infrared spectrum of silkworm pupa polypeptide binding calcium with different mass fraction of NaH2PO4

2.3.3磷酸化蚕蛹多肽的肽钙结合模式分析

多肽主要通过磷酸基团和羧基等活性基团与钙结合。酪蛋白经胃蛋白酶消化后生成酪蛋白多肽衍生物并被磷酸化，即生成CPPs，实际上是一系列含有磷酸丝氨酸簇的短肽-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-[18]。Ferraretto等[19]发现，CPPs核心序列上的磷酸丝氨酸残基可与钙结合形成Ca3(PO4)2纳米团簇，从而聚集钙离子并引起细胞对钙的摄取。从动物体中制备出的具有促进钙吸收作用的非磷酸化肽，主要通过所含谷氨酸(Asp)和天冬氨酸(Glu)上的羧基与钙结合。Bao等[20]研究发现，大豆蛋白肽(SPHs)的钙结合能力与羧基基团呈线性相关，并且最可能的钙结合位点是Asp和Glu的羧基。蚕蛹中蛋白质含量约为12%～16%，具有良好的氨基酸配比，且Asp和Glu含量最高，分别可达到总氨基酸的10%和14%左右[21]，可提供丰富的肽- 钙结合位点。Chen等[22]发现，钙离子可通过单配位基模式、双配位基模式和α模式与多肽结合。综合磷酸化位点检测结果和红外光谱分析结果，推测磷酸化蚕蛹多肽的肽钙结合模式如图3。

图3 磷酸化蚕蛹多肽的肽钙结合模式Fig.3 Binding mechanism of calcium and phosphorylated silkworm pupa polypeptide

2.4 扫描电镜分析结果

图4为蚕蛹多肽、肽钙复合物以及磷酸化改性后肽钙复合物的扫描电镜分析结果。由图4可看出，蚕蛹多肽表面光滑，结构紧实；蚕蛹多肽结合钙表面疏松多孔，与Wu等[23]制备的胶原多肽结合钙类似，这种结构有利于溶解吸收；磷酸化处理后，其表面更加致密了，可能与其结合钙含量较高有关。

图4 多肽与肽钙复合物的扫描电镜分析结果Fig.4 Results of SEM analysis of peptide and calcium-peptide complex

3 结 论

本研究利用Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6等3种试剂对多肽进行磷酸化改性，再制备多肽- 钙复合物。改性后多肽的钙结合率显著提高，且3种磷酸化试剂所制备样品的钙结合率无显著性差异。选择NaH2PO4为磷酸化试剂，蚕蛹多肽结合钙中的磷含量随着NaH2PO4添加量的增加而不断升高，但钙含量呈先升高后下降的趋势。当NaH2PO4质量分数为0.50%时，磷含量为116.41 mg/g，结合钙含量达到最大值，为202.32 mg/g。蚕蛹酶解产物中有17种肽段被磷酸化，增加磷酸化位点22个，主要是肽段中Ser、Thr的—OH与磷酸基团反应，从而增加与钙离子的结合位点。

本研究开发了一种蚕蛹多肽的磷酸化改性方法，发现适宜程度的磷酸化水平的多肽结合钙能力更强，希望该方法能够应用于其他多肽材料中，为进一步开发出高效的补钙制品提供理论参考和实践指导。