湖南常见辣椒品种游离氨基酸主成分分析及综合评价

葛 帅，王蓉蓉，*，王颖瑞，叶美玲，覃业优，丁胜华，周 辉，蒋立文，邓放明

(1.湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.盐津铺子食品股份有限公司，湖南 长沙 410000；3.长沙坛坛香调料食品有限公司，湖南 长沙 410128；4.湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125)

辣椒(CapsicumannuumL.)属茄科一年生或有限多年生草本植物[1]。2018年全球辣椒种植面积约199万ha，年产量3 677万t，其产值和效益不断增加[2]。辣椒中富含辣椒素、维生素C、多酚等多种成分，具有抗菌、除湿、祛寒等功效[3]。辣椒品种众多，湖南本地市售主要为大红椒、青尖椒、螺丝椒、小米椒、小红椒、大青椒等。由于不同品种在诸多品质方面存在较大差异，因此明确不同品种辣椒的理化品质，对辣椒资源的合理开发及利用具有重要意义。

游离氨基酸(free amino acid，FAA)是一种重要的活性物质，且作为重要呈味物质能丰富食品的味觉层次，并参与风味物质的合成。因此，FAA种类和含量的测定对评价食品营养及品质具有重要意义[4-7]。目前，关于食品中FAA的研究主要集中在猕猴桃[8]、荔枝[9]、橄榄[10]、黄花菜[11]、百合[5]、虫草[12]等方面。结果表明，FAA品质受种植地域环境、品种、取样部位等诸多因素的影响。辣椒作为深受大众喜爱的调味品，目前关于其FAA的研究仍较少。Cuadra-Crespo等[13]分析了甜椒贮藏过程中FAA的变化，共检出12种FAA，且低温(5 ℃)贮藏对其影响较小。然而，关于不同品种辣椒中FAA品质及呈味氨基酸的比较研究仍然较少。

主成分分析(principal component analysis,PCA)是一种多元统计分析方法，能通过降低数据维度，在损失较少原始数据信息的前提下将多个变量转化为几个不相关的综合变量[14-15]。目前，主成分分析已广泛应用于食品中FAA的品质评价，如桑椹[16]、猕猴桃[8]、百合[5]等，较好地体现了不同品种及取样部位的品质差异。因此，主成分分析是评价FAA品质的有效手段。

本研究采用高效液相色谱- 串联质谱法(HPLC-MS/MS)对湖南常见6种辣椒的FAA进行比较分析，并运用主成分分析和综合评价法比较不同品种辣椒的FAA品质，随后采用聚类分析对其进行相关性分析及分类，明确不同品种辣椒中FAA的品质差异，以期为辣椒资源的合理开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大红椒(湘研805，DH)、螺丝椒(旋妃，LS)、小红椒(飞艳，XH)、大青椒(珍黄100，DQ)，产地均为湖南省长沙市；青尖椒(湘辣712，QJ)和小米椒(美艳，XM)，产地为湖南省宁乡市。

氨基酸(缬氨酸Val、苏氨酸Thr、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、甲硫氨酸Met、亮氨酸Leu、赖氨酸Lys、异亮氨酸Ile、组氨酸His、精氨酸Arg、丝氨酸Ser、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly、谷氨酰胺Gln、谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp、酪氨酸Tyr、丙氨酸Ala、γ-氨基丁酸GABA、瓜氨酸Cit、鸟氨酸Orn、胱氨酸Cys-Cys、天冬酰胺Asn、羟脯氨酸Hpro、牛磺酸Tan、半胱氨酸Cys)标准品，色谱纯，北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

LGJ- 25G型冷冻干燥机，北京四环福瑞科仪科技发展有限公司；DE- 50g型万能粉碎机，浙江红景天工贸有限公司；TG16K- Ⅱ型台式高速离心机，长沙东旺实验仪器有限公司；LC- 20A型高效液相色谱仪、LCMS- 8045型三重四极杆质谱仪，岛津仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品制备

挑选成熟度一致、大小均一、颜色均匀、无病虫害和机械损伤的辣椒作为实验材料，每个品种取3份。将辣椒洗净、沥干、去蒂后，剩余的部分切碎，保留辣椒籽，置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，冷阱温度-50 ℃，绝对压力30 Pa，自动程序干燥48 h。随后将冻干样品粉碎后装入铝箔袋抽真空包装，于-20 ℃中保藏备用。

1.3.2氨基酸的提取

参考王馨雨等[5]的方法，精确称量各品种的冻干样品0.100 0 g，分别置于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水室温下超声(250 W，450 kHz)提取30 min，随后8 000 r/min离心15 min，提取上清液于100 mL容量瓶中，重复3次，定容后取适量溶液过0.22 μm水系微孔滤膜得待测液。

1.3.3标准混合溶液的制备

精确称取干燥至恒重的各氨基酸标准品适量，加入体积分数10%甲醇，配制成混合标准品储备液于4 ℃下保存。取不同体积的储备液稀释后，制成系列浓度的混合标准品溶液，进行线性关系分析。

1.3.4氨基酸组成分析

色谱条件：色谱柱为Shim-pack GIST-HP C18 (2.1 mm×100 mm×3 μm)；流动相A为水- 体积分数0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈- 体积分数0.1%甲酸溶液，流速0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

质谱条件：离子化模式为ESI+，扫描方式为多反应检测(MRM)，雾化器流量3.0 L/min，加热气流量10 L/min，碰撞气为氩气，干燥气流量10.0 L/min，加热块温度400 ℃，DL管温度250 ℃。26种氨基酸标准品色谱如图1。

图1 26 种氨基酸标准品HPLC-MS/MS色谱 Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of 26 standard amino acids

1.4 数据处理

根据HPLC-MS/MS内置数据库对各氨基酸进行定性定量分析，其含量用mg/g(以干质量计)表示；运用Excel绘制不同品种辣椒FAA组成模式图；味道强度值(taste active value,TAV)为氨基酸含量与其呈味阈值之比；运用Origin 2017绘制呈味氨基酸组成模式图及PCA得分图和载荷图；运用Origin 2017 Heat Map with Dendrogram绘制聚类热图；运用IBM SPSS Statistics 23软件进行相关性分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种辣椒FAA组成及含量分析

基于HPLC-MS/MS建立了26种氨基酸的测定方法，通过该方法在6种辣椒中共检出24种FAA，包括缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸和异亮氨酸8种必需氨基酸(essential amino acid，EAA)，组氨酸和精氨酸2种半必需氨基酸(semi-essential amino acid，SEAA)，色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、鸟氨酸、胱氨酸、天冬酰胺、羟脯氨酸14种非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)。Cuadra-Crespo等[13]通过超高液相色谱- 串联质谱法对5 ℃贮藏条件下的甜椒进行分析，共检测出12种FAA，较本研究少检出谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、鸟氨酸、天冬酰胺和羟脯氨酸，分析原因可能是原料品种和处理方式的差异。

6种辣椒都包含23种FAA，但其组成种类具有一定的差异性，见表1。相比其他3个品种，QJ、LS、DQ未检出胱氨酸，而DH、XM、XH未检出羟脯氨酸。与其他FAA相比，天冬酰胺质量分数最高，为1.72～6.92 mg/g；其次为谷氨酰胺，为1.23～2.59 mg/g(见图2)。此外，天冬氨酸(5%～9%)、丝氨酸(5%～10%)、γ-氨基丁酸(2%～8%)、赖氨酸(3%～5%)在6个品种辣椒中也占有较高的比例，且它们中的部分氨基酸还具有特殊生理功能，如天冬氨酸既是重要的呈味氨基酸(delicious amino acid，DAA)，也是一种良好的营养补充剂，具有调节脑神经代谢、治疗心脏病和高血压等功效[17]；γ-氨基丁酸药用价值较高，具有舒缓情绪、辅助降血压等功效[18-19]；赖氨酸具有促进生长发育和钙吸收等功效，并与人体免疫功能相关[20]，可见辣椒的药用价值有待进一步开发。整体来看，6个品种辣椒总游离氨基酸(total free amino acid，TFAA)质量分数在7.28～19.36 mg/g，其中DH的TFAA含量最高，几乎为LS的3倍，且除DH中未检出羟脯氨酸和含量差异较小的丝氨酸和鸟氨酸外，其余各FAA含量均显著(P<0.05)高于LS。QJ与XH相比，TFAA质量分数几乎相同，约为12.00 mg/g，但QJ中必需氨基酸比例略高于XH，呈味氨基酸比例小于XH，一定程度上说明XH相比QJ呈味效果更好。各品种间羟脯氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸变异系数较高，表明其含量差异较大；而鸟氨酸和胱氨酸变异系数较低，表明其含量差异很小。总体而言，6个品种辣椒所含FAA种类基本一致，但含量差异较大。

表1 不同品种辣椒FAA组成Tab.1 Composition of FAAs in different peppers

2.2 不同品种辣椒呈味氨基酸分析

FAA作为重要的呈味物质能提供鲜味、甜味、苦味等味觉，丰富了食品的味觉层次。根据侯娜等[21]的呈味氨基酸分类及氨基酸呈味特性，将氨基酸划分为鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸)、甜味氨基酸(苏氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸)、苦味氨基酸(甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸)。辣椒中呈味氨基酸含量从高到低依次为鲜味、甜味、苦味、芳香族氨基酸，见图3。鲜味氨基酸质量分数在1.41～2.88 mg/g，可见辣椒作为调味品主要赋予食品鲜味，其中DH(2.88 mg/g)、DQ(2.82 mg/g)、XM(2.63 mg/g)鲜味氨基酸质量分数较为突出。甜味氨基酸质量分数为1.22～3.01 mg/g，XM甜味氨基酸含量最高却未呈现较明显的甜味，推测其较高含量的辣椒素掩盖了甜味氨基酸的呈味作用[22]；DH除具有突出的鲜味外也具有较高含量的甜味氨基酸。苦味氨基酸质量分数为0.87～2.60 mg/g，不同品种辣椒间差异较大，DH含量最高，LS含量最低。芳香族氨基酸质量分数为0.32～0.87 mg/g，相比于其他3类呈味氨基酸，其在各品种辣椒中含量均较低。对比6种辣椒鲜味、甜味、苦味氨基酸含量发现，辣椒各类呈味氨基酸含量互有高低，但通常鲜味和甜味氨基酸含量高的辣椒，其苦味氨基酸含量也较高，这也可通过图2直观反映。由此可见，不同品种辣椒中各类呈味氨基酸组成比例类似，在各类氨基酸相互调和下，不同品种辣椒都呈现出相似且较为统一的呈味特点。

图2 不同品种辣椒FAA组成模式分析Fig.2 FAAs composition analysis of different peppers

图3 不同品种辣椒呈味氨基酸组成模式分析Fig.3 Delicious amino acids composition analysis of different peppers

由于各氨基酸有不同的呈味阈值，单从含量上无法准确分析呈味氨基酸对辣椒风味的贡献，故引入TAV对辣椒呈味氨基酸进行评价，见表2。当TAV>1时，表明该呈味氨基酸对风味贡献大，且数值越大呈味作用越明显；当TAV<1时，表明该呈味氨基酸对风味贡献小，呈味作用不明显[23-24]。鲜味氨基酸中对风味贡献大的分别为谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸。相比于其他品种辣椒，DH中谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸 TAV均大于1；XM中谷氨酸TAV最高，而阈值较低，呈味作用显著，其含量高低直接决定食品的鲜美程度；DQ中天冬氨酸对鲜味贡献最大，常被作为一种鲜味剂，与呈味核苷酸并用，在发达国家中逐渐代替味精使用[11]。甜味氨基酸中，对风味贡献大的为组氨酸，其在DH和XM中TAV均大于1，分别为1.52和1.31，呈现出更显著的甜味特点。苦味氨基酸中，精氨酸和缬氨酸对风味贡献较大，且这2种氨基酸药用价值也较高，具有调节血糖的功能[4,25]。其中，甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸在各品种辣椒中TAV均小于1，可有效增强其他呈味氨基酸的鲜味和甜味[26]。芳香族氨基酸中，胱氨酸在DH、XM和XH中呈味贡献最大，其TAV均大于6；而苯丙氨酸和酪氨酸TAV都低于1，呈味作用不明显。总体而言，辣椒中鲜味氨基酸TAV较甜味、苦味氨基酸高，鲜味特征显著，符合辣椒的呈味特点，其中XM、DH鲜味最为突出，甜味和苦味能一定程度上起到协调风味的作用。

表2 不同品种辣椒呈味氨基酸TAV分析Tab.2 TAV analysis of delicious amino acids of different peppers

2.3 不同品种辣椒FAA相关性分析

对6种辣椒的24种FAA成分进行相关性分析，氨基酸相关系数矩阵如表3。由表3可知，大部分氨基酸含量间呈正相关，部分氨基酸含量间还呈极显著正相关，如苏氨酸与苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺呈极显著正相关(P<0.01)；苯丙氨酸与脯氨酸、组氨酸、天冬酰胺呈极显著正相关(P<0.01)；亮氨酸与异亮氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸呈极显著正相关(P<0.01)；组氨酸与甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺呈极显著正相关(P<0.01)等。大多数氨基酸间的相关系数绝对值大于0.3，表明各氨基酸间的相关性较强，即可以通过主成分分析对各品种辣椒的FAA进一步分析。

表3 FAA相关系数矩阵Tab.3 Correlation coefficient matrix of FAAs

2.4 不同品种辣椒FAA主成分分析

经主成分分析共提取4个主成分，其中主成分1贡献率最大(59.837%)，表明主成分1对辣椒品质的影响最大，见表4。前3个主成分特征值均大于1，其累计贡献率高达92.496%，说明前3个主成分基本可反映不同品种辣椒FAA的大部分信息，故选取前3个主成分作为数据分析的有效成分。

表4 主成分的特征值和贡献率Tab.4 Eigenvalue and their contribution of principal components

前3个主成分的特征向量与载荷矩阵如表5，载荷值反映了各FAA与主成分间的相关系数，载荷值的绝对值越大，表明该氨基酸对主成分影响越大，正号表示对主成分正向影响，负号表示对主成分负向影响[11,16]。由表5可知，天冬酰胺、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、谷氨酸、色氨酸、丝氨酸对主成分1贡献最大，其中天冬酰胺、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸载荷值均大于0.9，且呈显著正相关。主成分2中，羟脯氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、丙氨酸、天冬氨酸贡献最大。然而，主成分3中鸟氨酸的载荷值为-0.855，对主成分呈负相关。

表5 主成分的特征向量与载荷矩阵Tab.5 Eigenvectors and loading matrix of principal components

不同品种辣椒PCA分析见图4。如图4(a)可知，各种辣椒较好地分散在不同区域，两点间距离越长表明相关性越低，两者品质特性差异越大，距离越短说明相关性越高，两者间品质差异越小[27]。根据各点的分布情况与距离关系，大致划分为3个区域。其中，DQ、QJ分布于第一、二象限，LS、XH分布于第三象限，XM、DH分布于第四象限，聚集在同一区域表示两品种间品质较为接近。由图4(b)可知，一些氨基酸的信息在主成分分析过程中丢失，箭头的长度反映了信息的丢失程度，箭头越短丢失的信息越多[28]，同时也反映了各氨基酸在其主成分中载荷值的大小。如谷氨酸、色氨酸、丝氨酸、鸟氨酸信息损失较多，其在主成分1中载荷值较小，但总体上大部分氨基酸的信息在主成分分析中都得到较完整的保留，表明主成分分析是一种非常可靠的数理统计分析方法。此外，FAA主要集中在第一、四象限，如谷氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸和缬氨酸等集中在第四象限，表明这些氨基酸对XM和DH贡献大，且其在XM和DH中都有最高的含量，推测这些氨基酸与XM和DH的品质相关。第二象限中仅有羟脯氨酸和γ-氨基丁酸，它们对PC1呈负向影响，而其他氨基酸均对PC1呈正向影响。

图4 不同品种辣椒的PCAFig.4 PCA of different peppers

2.5 不同品种辣椒FAA的综合评价

由表4可知，前3个主成分的特征值均大于1，且累计贡献率高达92.496%，通常认为累计贡献率高于85%，即可描述整体水平并可提取主成分构建综合评价模型[14]，因此提取前3个主成分代替24种FAA指标对FAA进行分析。根据主成分的特征向量得到辣椒中FAA的前3个主成分线性关系为：

F1=0.262X1+0.260X2+0.259X3+
0.256X4+…+0.103X21+0.120X22+
0.146X23+0.110X24；
F2=-0.009X1+0.026X2-0.043X3+

0.099X4+…+0.378X21+0.319X22+

0.268X23-0.033X24；

F3=0.021X1-0.069X2+0.031X3-
0.040X4+…-0.149X21+0.309X22-
0.242X23-0.520X24。

由于任何单一主成分都无法代表辣椒中总游离氨基酸的水平，故以各主成分对应的贡献率作为权重，对3个主成分加权求和，得到辣椒中FAA综合评价表达式：F=0.647F1+0.231F2+0.122F3。通过表达式计算得到各品种辣椒得分如表6，得分越高，表明该辣椒FAA综合品质越好。由表6可知，第一、二、三主成分得分最高的分别为DH、DQ、XM，说明这些组分分别对DH、DQ、XM的FAA品质影响最大。根据总分情况得到各辣椒的FAA品质排名，从高到低依次为DH、XM、DQ、QJ、XH、LS，表明各辣椒间的FAA品质存在较大差异。其中DH和XM得分均大于2，品质较好；LS得分最低，为-3.862，品质最差。

表6 不同品种辣椒的成分得分和综合评估Tab.6 Principal component scores and comprehensive scores of different peppers

2.6 不同品种辣椒FAA聚类分析

为进一步分析各品种辣椒中FAA，采用ward最小方差和欧式距离法对数据进行聚类分析。聚类分析是一种能对大量的数据进行归类的多元统计法，并能通过可视化图形直接反映样品的相关程度。不同品种辣椒热图聚类如图5，原始数据经过标准化处理，图5中色块颜色深浅表示氨基酸含量的高低，横向为各品种辣椒的聚类，纵向为FAA的聚类，聚为同类的表示两者相关程度高，欧式距离越短表示相关程度越高。从各品种辣椒聚类结果来看，6种辣椒被分为3类，分别是XH与LS、DQ与QJ、XM与DH，其中DQ与QJ相关程度最高，表明DQ与QJ品质较为接近。被聚为同类的辣椒在FAA总含量及综合得分上均较为相近，聚类结果也与PCA结果一致，表明聚类结果准确可靠。从各FAA聚类结果来看，大致可将其分为5类：第1类氨基酸为缬氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和丙氨酸，其主要为呈味氨基酸，故被归为一类；第2类为苏氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸，其为第一主成分主要贡献氨基酸；第3类为γ-氨基丁酸、瓜氨酸、羟脯氨酸，其均为非呈味氨基酸和第二主成分主要贡献氨基酸；第4类为胱氨酸和鸟氨酸，其在辣椒中含量较低；第5类为色氨酸与谷氨酸，其在XM中均具有较高的含量，都为呈味氨基酸和第一主成分主要贡献氨基酸。这些氨基酸中，苏氨酸和天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺、亮氨酸和异亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸呈现较强的相关性，与表3相关系数矩阵结果一致。

图5 不同品种辣椒聚类分析Fig.5 Cluster analysis of different peppers

3 结 论

基于高效液相色谱- 串联质谱建立了26种氨基酸的测定方法，通过该方法共检出湖南常见辣椒DH、QJ、LS、XM、XH、DQ中24种FAA，包括8种必需氨基酸、2种半必需氨基酸、14种非必需氨基酸。不同品种辣椒FAA组分存在一定差异，QJ、LS和DQ中未检出胱氨酸，而DH、XM和XH中未检出羟脯氨酸。相比于其他FAA，天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、γ-氨基丁酸、赖氨酸在各辣椒中质量分数均较高，其分别达到1.72～6.92、1.23～2.59、0.67～1.43、0.74～1.30、0.40～0.95、0.32～0.76 mg/g。不同品种辣椒TFAA质量分数在7.28～19.36 mg/g，其中DH的TFAA含量最高，LS含量最低。部分药用氨基酸，如天冬氨酸、γ-氨基丁酸、赖氨酸在各品种辣椒中都具有较高的含量，表明辣椒具有潜在的药用开发价值。辣椒中呈味氨基酸含量从高到低依次为鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、芳香族氨基酸。通过TAV分析发现，鲜味氨基酸是辣椒的主要呈味氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸对鲜味贡献较大，DH与XM较其他品种辣椒鲜味更为突出，更具风味价值，而其他呈味氨基酸起到协调风味的作用。通过聚类分析发现DH与XM、DQ与QJ、XH与LS品质较为接近，部分氨基酸，如苏氨酸与天冬酰胺、精氨酸与谷氨酰胺、亮氨酸与异亮氨酸、苯丙氨酸与脯氨酸呈现较强的相关性。由主成分分析及综合评价发现，DH、XM、DQ中FAA品质优于QJ、XH、LS。