树鼩源大肠埃希氏菌耐药性分析与毒力因子鉴定

方 茜，梁锦宁，温 莎，郭晓萍

(广西医科大学实验动物中心，广西南宁 530021)

树鼩是生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，在我国云南、贵州、广西、广东等地广泛分布。由于其与人类在细胞与分子层面的相似性，鼩已在肿瘤学、内分泌学、神经生物学、生殖生物学、免疫学及感染性疾病等方面有广泛和深入的应用[1]。树鼩作为新型的实验动物，来源于自然环境，其实验动物化首先要排除人兽共患病，如空肠弯菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌等肠道病原菌[2]。普通级树鼩在人工繁育过程中，曾有病原微生物所致树鼩暴发腹泻少数致死的情况，而大肠埃希氏菌是引起腹泻的常见病原微生物[3]。目前树鼩源大肠埃希氏菌所携带的毒力基因检测和耐药性的研究报道很少，因此本研究对广西南宁某大学人工驯化养殖实验室中的10份树鼩肠道内容物进行了大肠埃希氏菌的分离鉴定、同源性分析，常规毒力基因检测及耐药性分析，以期为树鼩的正常饲养繁殖和树鼩大肠杆菌病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 广西南宁某大学人工驯化养殖实验室中的10只树鼩肠道内容物。

1.1.2 试剂、培养基和药敏纸片 DNA标准DL 5 000，生工生物工程(上海)股份有限公司产品； DNA mix，TaKaRa公司产品； 血琼脂培养基、麦康凯培养基，北京陆桥技术股份有限公司产品；细菌微量生化反应管及临床常用14种药敏纸片，南宁市生化药品仪器有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 PCR 仪、Gel Doc TM EZ imager凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品；XSP-8CA生物显微镜，上海光学仪器一厂产品；SW-CJ-2F双人双面净化工作台,苏州净化设备有限公司产品；150A/250B数显生化培养箱,江苏省金坛市江南仪器厂产品；TGL-16K台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化 无菌操作取树鼩肠道内容物，分别接种于血琼脂平板上，置于37℃恒温培养24 h，挑取大小一致、色泽鲜明的单个大肠埃希氏菌可疑菌落，用麦康凯选择性培养基进行纯化分离。观察菌落并挑取形态特征一致的菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 生化反应 将分离纯化的菌株按说明书进行操作，接种于葡萄糖、木糖、乳糖、麦芽糖、鸟氨酸、赖氨酸、尿素酶，于37℃恒温培养箱培养24 h，观察分离菌的生化特性并参照文献进行鉴定[7]。

1.2.3 细菌16S rRNA的PCR检测 参照细菌DNA提取试剂盒说明书提取分离菌株基因组DNA。设计16S rRNA通用引物，引物序列为：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTGTTACGACTT-3′)，预期扩增长度1 465 bp。PCR反应体系(20 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，细菌基因组2 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环；72℃ 10min。将PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，然后胶回收送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果与GenBank中参考株的基因序列进行比对，采用MEGA6.0软件中的Neighbor-Joining法建立其系统发育树并采用DNA Star 7.1进行同源性分析。

1.2.4 药物敏感性试验 通过WTO推荐的Kirby-Bauer(K-B)纸片琼脂扩散法测定14种抗菌药物的耐药性，参照美国临床与实验室标准化协会(CLSI)文件(M100-S21)进行结果判定。

1.2.5 毒力因子基因扩增 参考相关文献[8-9]对9种毒力基因进行PCR扩增，扩增引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系(20 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，细菌基因组2 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s(表1)，72℃ 35 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.6 耐药基因PCR检测 参考相关文献[10-14]扩增β-内酰胺类blaSHV、blaTEM、CTM-X、OXA-48基因，四环素类tetA、tetB基因 ，喹诺酮类qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因，氨基糖苷类aac(3)-Ⅱ基因，引物信息详见表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以合成的引物进行耐药基因PCR扩增，PCR反应体系(20 μL)上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，细菌基因组2 μL，2×TaqPCR Master Mix 10μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s(表2)，72℃ 35 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 大肠埃希氏菌毒力因子PCR信息

2 结果

2.1 菌株分离鉴定

初步分离的疑似菌在绵羊血琼脂培养基上长出较均一的圆形、边缘整齐、表面有光泽的灰色菌落，在麦康凯培养基上长出边缘光滑整齐、粉红色扁圆形小菌落(图1)。经革兰氏染色后，在显微镜下观察为革兰氏阴性菌，单个或成对存在，无芽孢，有菌毛，两端钝圆的粗短杆菌(图2)，10份肠道内容物共分离出9株疑似菌株，分别命名为TB1、TB2、TB3、TB4、TB5、TB6、TB7、TB8、TB9。

2.2 生化反应结果

9株分离株均可利用葡萄糖、木糖、乳糖，且靛基质试验为阳性，尿素、枸橼酸盐试验为阴性，9株分离菌与《伯杰氏细菌鉴定手册》中的大肠埃希氏菌生化特性相符(表3)。

2.3 分离株16S rRNA基因扩增结果及遗传进化分析

将16S rRNA基因扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带与预期相符(1 465 bp)(图3)。序列对比结果表明，分离株16S rRNA基因序列与GenBank中大肠埃希氏菌参考株16S rRNA基因序列的相似性达99%。用MEGA 6.0软件和MegAlign软件对分离株的16S rRNA基因序列与参考菌株(表4)构建遗传进化树,并进行相似性分析，结果表明，TB1、TB3、TB4、TB5、TB7、TB8与MG602206鸡源性大肠埃希氏菌和MH671425猪源性大肠埃希氏菌处于较近一支；TB6与JF513979猪源性大肠埃希氏菌处于较近一支；TB2与KU156692人源性大肠埃希氏菌处于较近一支(图4)，TB1～TB9的相似性在98.9%以上，其余分离株与参考株相似性均在97.5%以上(图5)。

表2 耐药基因引物序列及扩增条件

图1 菌落形态观察

图2 革兰氏染色镜检图(100×)

表3 分离菌株生化鉴定结果

2.4 细菌药敏试验结果

9株分离菌株中，仅TB2、TB3对氨苄西林高度敏高(抑菌圈直径≥15 mm)，其他菌株对氨苄西林均耐药(抑菌圈=0 mm)。TB8对头孢噻肟耐药，其他菌株对头孢噻肟高度敏感。TB4、TB5对头孢拉定耐药，其他菌株对头孢拉定中度和高度敏感(10 mm≤抑菌直径<15 mm)。TB8对苯唑西林高敏，其他菌株均对苯唑西林耐药。TB1、TB3、TB4、TB9对四环素耐药，其他菌株对四环素中度敏感。TB1、TB2、TB7、TB8对多西环素耐药，其他菌株对多西环素中度或高度敏感(表5)。TB8、TB9对氧氟沙星耐药，其他菌株对氧氟沙星中度或高度敏感。分离菌株对其余7种药呈现中度或高度敏感。

M.DNA 标准DL 5 000;1～9.分离株TB1～TB9；N.阴性对照

表4 大肠埃希氏菌遗传进化分析参考菌株

图4 分离菌株16S rRNA基因基序列进化树

图5 分离菌株与部分大肠埃希氏菌16S rRNA基因核酸序列同源性对比

2.5 毒力基因检测结果

对分离鉴定的菌株进行9种毒力基因PCR扩增(图6)，只有eaeA基因扩增出来，9株分离株均携带eaeA毒力基因，未检测到LT、STa、STb、escV、ST×1、ST×2、pic、aggR毒力基因。

M.DNA 标准DL 1 200;1～9.分离株TB1～TB9；N.阴性对照

2.6 耐药基因检测结果

9株分离株均检测到tetA、tetB、TEM耐药基因，检出率为100%，TB4、TB5、TB8、TB9分离菌株检测出CTX-M耐药基因，检出率为44.4%，其他耐药基因均未检测出(图7～图10)。

M.DNA 标准DL 600;1～9.分离株TB1～TB9；N.阴性对照

M.DNA 标准DL 600;1～9.分离株TB1～TB9；N.阴性对照

M.DNA 标准DL 600;1～9.分离株TB1～TB9；N.阴性对照

M.DNA 标准DL 1 200;4、5、8、9.分离株TB4、TB5、TB8、TB9；N.阴性对照

3 讨论

大肠埃希氏菌作为肠道中重要的正常菌群，属于条件致病菌，当宿主免疫力下降或者细菌侵入肠道外组织或器官时，就会引起疾病。本文对10份普通级树鼩的肠道内容物进行大肠埃希氏菌的分离培养，共分离出9株大肠埃希氏菌。对分离菌进行药敏试验和耐药基因的检测，发现9株大肠埃希氏菌对头孢哌酮最为敏感， 对头孢他啶、庆大霉素、米诺环素高度敏感，对苯唑西林耐药率为88.8%，对氨苄西林耐药率77.8%，对四环素耐药率为44.4%，可能在日常饲养时存在氨苄西林、四环素等药物的滥用现象。扩增耐药基因，共检测出β-内酰胺类耐药基因TEM、CTX-M，四环素类耐药基因tetA、tetB等4种基因。细菌的耐药性与相关的耐药基因的检出率基本呈正相关。通过对所分离出的大肠埃希氏菌进行16S rRNA 测序，并与其他动物源大肠埃希氏菌序列构建进化树分析，发现分离株与猪源大肠埃希氏菌、鸡源大肠埃希氏菌、人源大肠埃希氏菌亲缘关系较近，提示分离株可能成为树鼩与其他动物交叉感染的潜在病原。对9株分离菌株进行9种毒力基因的检测，发现eaeA毒力基因的携带率为100%，其余毒力基因均未检出，说明这9株分离株腹泻大肠埃希氏菌病原主要以肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)为主。

表5 分离菌株药敏试验结果

树鼩作为一种特殊的实验动物已被应用于多种疾病的研究，虽然已有一些树鼩微生物检测的相关报道，但对树鼩身上所携带的病原微生物的详细研究还不够深入，本文通过对从树鼩肠道内容物分离出的9株大肠埃希氏菌进行分型鉴定、分析其与其他动物源大肠埃希氏菌的亲缘关系，并进行耐药性分析和毒力因子鉴定，为进一步了解树鼩源大肠埃希氏菌提供参考依据。