过表达冷诱导RNA结合蛋白对BHK-21细胞增殖的影响

朱 鑫，冉丹丹*，汤 承，岳 华

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA binding protein，CIRP)又称为A18 hnRNP，属于RNA结合蛋白中的核内异质核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)家族，是一种在脊柱动物的组织器官内广泛存在且表达高度保守的蛋白。近年来，CIRP作为研究重点，其许多功能被相继证实，如人们发现CIRP除了在低温(29℃)刺激下表达明显增高外，还能被其他应激条件如缺氧、紫外线等诱导而过量表达，并对细胞在上述应激条件下起到保护作用[1-3]。在丝裂原活化蛋白激酶信号通路 (MAPK/ERK)和核因子κB信号通路(NF-κB)的调控中均有CIRP的参与，其中MAPK信号通路中的ERK1/2途径在调节细胞增殖过程当中起关键性作用[4-5]，CIRP还能参与调节细胞的基本功能，包含细胞增殖和凋亡、细胞周期以及细胞骨架等过程[6-8]。

CIRP作为一个多功能蛋白，对作为生命最基本单位的细胞发育过程有重要的作用。在试验细胞进行H2O2处理过程中，CIRP表达下调加重细胞凋亡，CIRP对心脏氧化应激诱导的细胞凋亡具有保护作用[9],CIRP可能参与SISAP引起的早期肝损伤的病理进程[10]。在雄性小鼠未成熟的精细胞中，CIRP通过与双重特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1B(Dyrk1b)相互作用来调节一些蛋白的磷酸化水平，从而促进未分化精原细胞的增殖。本试验通过对CIRP过表达的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)进行研究，探索CIRP对BHK-21细胞增殖情况的影响，为研究CIRP的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 CIRP稳定过表达及敲低CIRP的BHK-21细胞系由西南民族大学动物医学四川省重点实验室构建[11]及保存；CIRP过表达的BHK-21标记为BHK-21-Cirp，CIRP敲低的标记为BHK-21-ShCirp，只含有绿荧光报告载体的标记为BHK-21-GFP。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM基础培养基、胰蛋白酶，美国Hyclone公司产品；碘化丙啶，美国Sigma公司产品；伊红染液、苏木素染液，常德比克曼生物科技有限公司产品。高速冷冻离心机(centrifuge 5804)，德国Eppendorf公司产品；Casy TT细胞计数仪，瑞士Roche公司产品；冷场发射扫描电子显微镜S-4800，日本Hitachi公司产品；流式细胞仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21细胞系 由本实验室构建Cirp过表达BHK-21细胞系后，经过8次左右的传代培养，BHK-21细胞的形态发生变化，将其标记为BHK-21-Cirp△。HE染色法观察BHK-21细胞的形态，扫描电镜观察比较BHK-21的形态，细胞样品经过清洗、固定、梯度脱水、干燥和镀金后置于扫描电镜下观察，用数码成像系统采集适当的样品图像。

1.2.2 BHK-21细胞生长曲线的绘制及比生长速率的计算 用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分别与BHK-21-GFP进行比较。第1组为BHK-21-Cirp△和BHK-21-GFP，第2组为BHK-21-ShCirp和BHK-21-GFP。将在25 cm2培养瓶中生长良好的BHK-21细胞消化制成悬液，按照Casy TT细胞计数仪的使用方法进行细胞计数。 第1组的细胞起始浓度为3.2×105个/mL，第2组的细胞起始浓度为5.2×105个/mL，将其接种到六孔细胞培养板中，加入完全培养基，每孔终体积为2.5 mL。将细胞置于5% CO2、37℃培养箱中培养并观察细胞生长情况。以24 h为一个时间间隔，每次取3个孔的细胞，用胰蛋白酶消化后进行细胞计数及记录数据。

(1)

1.2.3 流式细胞术检测比较BHK-21的细胞周期 将生长状态良好的BHK-21-Cirp△、BHK-21-GFP、BHK-21-ShCirp用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，收集后经过清洗、固定，用含2.5 ml/L Triton X-100的PBS处理细胞5 min，用PBS清洗后加入1mL浓度为50 μg/mL 的碘化丙啶(PI)重悬细胞，室温染色30 min。上机检测前用300目滤网将样品过滤。

2 结果

2.1 BHK-21细胞形态的变化

经过反复冻存和复苏，按照上述培养细胞的方法传代培养至第8代左右时，BHK-21的细胞形态由原本的梭形逐渐变为了圆形，将其标记为BHK-21-Cirp△(图1),图1中A、B、C为相邻3代BHK-21细胞8 h的生长情况，可见每传1代，形态变圆的细胞数量就越多；D、E、F为A、B、C对应代次细胞24 h后的生长情况，也可清晰观察到细胞变圆的过程。

图1 BHK-21细胞形态的变化过程(100×)

HE染色结果见图2。由于漂洗原因，细胞核被苏木精染成了明显的蓝色或浅蓝色，细胞质被伊红染成了粉红色，部分接近紫色。染色结果可见BHK-21变形细胞的细胞核明显增大，且大小不一，整个细胞呈饱满状，核质比显著高于正常形态的细胞。BHK-21正常细胞的细胞核较小，且大小均一，细胞呈细长状。

图2 BHK-21细胞HE染色结果(200×)

图3中D、E、F分别为BHK-21正常形态在1 000×、2 000×、3 000×的形貌，细胞呈梭形，扁平状，表面较为光滑，细胞表面只具有较少的微绒毛，无泡状物；图3A、B、C分别为BHK-21异常形态在1 000×、2 000×、3 000×的形貌，细胞呈圆形，且饱满，表面不光滑，其中B和C可见细胞周围具有大量的伪足和泡状物，细胞由梭形变为了不规则的圆形，细胞表面极不光滑，周围具有较多泡状物，每个细胞几乎都有许多长且发达的伪足，这些伪足从细胞膜边缘伸出到无细胞区域，有的与邻近细胞的伪足相互紧密连接或嵌合。

图3 扫描电镜观察结果

2.2 CIRP促进了BHK-21细胞的增殖

图4 BHK-21-CIRP和BHK-21-GFP的细胞形态(100×)

图5 BHK-21细胞的增殖曲线

2.3 CIRP对BHK-21细胞周期的影响

细胞周期共包含静止期/DNA合成前期(G0-1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)。经过乙醇固定，Triton X-100处理，PI对DNA进行染色后，使用流式细胞仪检测细胞周期，结果显示，BHK-21-Cirp△(A)、BHK-21-GFP(B)、BHK-21-ShCirp(C)处于G0-1期的DNA含量比例(即细胞数量比)依次为52.4%、55.3%和66.7%，处于S期的DNA含量比例依次为26.1%、24.7%和19.7%(图6)，说明在其他条件相同的情况下，CIRP能够促进BHK-21细胞提前进入S期，加快了细胞周期的进程，从而促进BHK-21细胞的增殖。

3 讨论

本试验经过连续传代培养CIRP过表达的BHK-21细胞，发现BHK-21细胞的形态变为圆形。随后采用HE染色法观察了其细胞核与细胞质的变化，并用扫描电镜观察对比了BHK-21的细胞形态。根据HE染色结果显示，变圆的BHK-21细胞的细胞核明显增大，且大小不一，核质比显著高于正常形态的细胞，生长速度明显加快。用扫描电镜观察BHK-21的细胞形态能够更加清晰且直观的看到变圆的BHK-21细胞具有大量发达的伪足。伪足结构是区别于正常细胞的明显特征，并且在肿瘤细胞中，伪足也是其活跃的运动力和侵袭力的重要结构基础，伪足对肿瘤细胞黏附、侵袭、运动、支撑、营养摄取等过程有关键性的作用[12-14]。因此，推测CIRP过表达使BHK-21细胞突变为肿瘤细胞。

图6 BHK-21细胞周期的检测结果

细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的全部过程。作为细胞活动最基本的过程，对细胞增殖的影响至关重要。在细胞周期的4个阶段都有相应的细胞周期蛋白、细胞周期依赖激酶(CDK)和细胞周期依赖激酶抑制剂进行协作控制。研究发现，CIRP的过表达可以调控小鼠胚胎成纤维细胞中ERK信号通路，激活细胞周期蛋白cyclin D1、S4等蛋白的合成，加快细胞周期的前进，最终达到促进细胞增殖的作用。过表达的CIRP通过与双重特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1B(Dyrk1b)互作，调节cyclin D1蛋白和p27蛋白的磷酸化水平以及Dyrk1b与p27的结合来促进未分化的精原细胞的增殖作用[15]。CIRP能够通过调节细胞周期蛋白来加快细胞周期的进程，促进细胞增殖。本试验用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分别与BHK-21-GFP进行比较，通过绘制其增殖曲线，计算比生长速率，以及采用流式细胞仪检测其细胞周期，证实了CIRP过表达能够促进BHK-21细胞从G0-G1期进入S期，加快细胞周期的进程，最终达到促进细胞增殖的作用。因此，推测CIRP能够通过与细胞周期蛋白相互作用或者调节细胞周期蛋白活性，从而调控细胞周期的进程，最后促进细胞增殖。

本试验经过连续传代发现BHK-21细胞的形态发生了变化，并对其细胞形态进行了观察和比较，推测CIRP过表达使其突变为肿瘤细胞。证实了CIRP过表达能够通过加快BHK-21的细胞周期，从而促进BHK-21细胞的增殖，为深入研究CIRP对细胞生长发育的作用提供参考。