布鲁氏菌OMP16抗体的间接ELISA方法建立

田路路，李会玲，支飞杰，王小雨，翟云逸，靳亚平，王爱华*

(1.西北农林科技大学动物医学院/农业农村部动物生物技术重点实验室，陕西杨凌 712100；2.陕西省畜牧技术推广总站，陕西西安 710016)

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患病，导致家畜流产和不孕。布鲁氏菌可在脾脏、肝脏、淋巴结等网状内皮系统中持续存在。其宿主多以牛、羊、猪等家畜为主，也可感染海豚等海洋动物及野生动物[1]。人感染后主要表现反复发热、关节疼痛、骨骼肌肉衰弱[2]。为促进畜牧业健康发展，布鲁氏菌病的防控净化已成为形势所需。对布鲁氏菌病的早期准确诊断在控制和根除布鲁氏菌病以改善公共卫生方面起着重要作用[3]。虎红平板凝集试验是最常见的布鲁氏菌病检测方法，但该方法灵敏度低、假阳性率高。ELISA是一种用于检测特异性抗体和可溶性抗原的免疫测定技术，该方法敏感度高、操作简单、特异性强、适用范围比较广泛。该方法对布鲁氏菌病的诊断和血清流行病学调查具有重要的作用[4]。布鲁氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)16是一种与肽聚糖相关的保守性脂蛋白，广泛存在于布鲁氏菌的6个种属[5]。本试验表达、纯化出布鲁氏菌OMP16，并以纯化的布鲁氏菌OMP16作为包被抗原，建立检测布鲁氏菌抗体的间接ELISA法，为布鲁氏菌病检测及疫苗评价等提供一种灵敏度高的技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和血清样本 猪布鲁氏菌S2疫苗株，由陕西省动物卫生与屠宰站惠赠；大肠埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)感受态细胞由天根生化科技(北京)有限公司生产；质粒pET-32a由农业农村部动物生物技术重点开放性实验室保存；40份布鲁氏菌病虎红平板凝集试验检测的阴性血清，100份血清样本采自陕西省某未免疫布鲁氏菌病疫苗的奶山羊场。

1.1.2 主要试剂 过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，西安晶彩生物科技有限公司； His-Tag抗体(小鼠单抗)，碧云天生物科技有限公司；ClonExpress®Ⅱ One Step Cloning Kit，南京维诺赞生物科技有限公司；大豆胰蛋白胨琼脂粉(TSB)，北京奥博星生物技术有限责任公司；质粒小提中量试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；脱脂奶粉，TMB显色液和NTA树脂层析柱，碧云天生物科技有限公司；布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原及其相应标准阳性和阴性血清，中国兽医药品监察所。

1.1.3 主要仪器 移液器，德国Eppendorf公司；电子天平，美国D-I-C公司；台式高速低温离心机，德国Eppendorf公司；PCR仪，北京赛百奥科技有限公司；核酸电泳仪，美国Millipore公司；凝胶成像仪，上海天能科技有限公司；电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；超声波细胞粉碎仪，宁波新艺超声设备有限公司；酶联免疫检测仪，北京Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌S2菌株基因组的提取 用无菌生理盐水溶解B.suisS2活疫苗株，采用平板画线法接种到大豆胰蛋白胨琼脂(TSA)平板上，倒置在37℃恒温培养箱中培养72 h，挑取生长良好的菌落接种到胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基，在37℃恒温摇床培养48 h，按照细菌基因组提取试剂盒说明提取布鲁氏菌基因组。

1.2.2 PCR扩增布鲁氏菌Omp16基因片段 根据GenBank上公布的布鲁氏菌Omp16基因序列，应用Primer Primer 5.0软件设计上、下游引物，引物的上、下游引入EcoRⅠ酶切位点，用 Prime-Blast 检测所设计引物的特异性。引物由西安擎科泽西生物科技有限公司合成。以B.suisS2菌株基因组为模板，进行Omp16基因扩增，反应体系：0.5 μL Prime Star DNA polymerase，4 μL 5×PS buffer， 2.5 μL dNTP mixture，1 μL模板，上、下游引物各0.5 μL，双蒸水11 μL。反应程序：98℃ 2 min；98℃ 20 s，53℃ 15 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸10 min。扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 重组原核表达载体pET32a-Omp16的构建 用EcoRⅠ对原核表达载体pET-32a进行酶切，酶切产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳。使用DNA纯化回收试剂盒进行目的片段胶回收。

将胶回收的目的片段与经酶切后的质粒pET-32a以1∶1的摩尔比在37℃水浴连接30 min，连接产物转化大肠埃希氏菌DH5α，涂布含有氨苄的LA平板，倒置在37℃恒温培养箱培养12 h后，挑取生长良好的单个菌落接种到含有氨苄的LB培养液，37℃恒温摇床培养12 h，使用质粒小提中量试剂盒提取重组载体。将PCR鉴定正确的质粒送西安擎科泽西生物科技有限公司测序。

1.2.4 重组蛋白OMP16的诱导表达 取构建好的重组质粒pET32a-Omp16转化大肠埃希氏菌感受态BL21(DE3)，在摇床复苏1 h后，涂布到含有氨苄的LA平板上，倒置在恒温培养箱中培养12 h，挑取单个菌落，接种到含有氨苄的LB培养液，在37℃摇床培养至对数期(OD600nm≈0.6)时，加入诱导剂IPTG(终浓度为1.0 mmol/L)，22℃条件下诱导8 h，5 000 r/min离心收集菌体，冰上超声裂解，12% SDS-PAGE电泳检测重组蛋白OMP16的表达。

1.2.5 重组蛋白Omp16的纯化及鉴定 经大量诱导表达的OMP16分泌表达菌[大肠埃希氏菌BL21(DE3)]在超声裂解后离心取上清，按照His蛋白纯化试剂盒说明书纯化重组蛋白OMP16，将纯化的OMP16于PBS中透析过夜，用PEG8000浓缩，120 g/L SDS-PAGE电泳鉴定，并用His-tag单抗作为一抗进行Western blot鉴定,同时使用羊布鲁氏菌标准阳性血清作为一抗，HRP标兔抗羊IgG作为二抗进行Western blot，鉴定分析重组蛋白OMP16和羊布鲁氏菌血清的免疫反应性。

1.2.6 iELISA方法建立 采用方阵滴定法筛选OMP16包被浓度和阳性血清最佳稀释倍数。将重组蛋白OMP16用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)分别稀释成2、1.5、1、0.5 μg/mL包被ELISA板，每孔加样100 μL，4℃包被过夜，PBS′T洗涤5次，每次30 s。每孔加入200 μL 50 g/L的脱脂奶粉，37℃封闭1 h, PBS′T洗涤5次后，阴性血清，阳性血清用50 g/L的脱脂奶粉按1∶10、1∶100、1∶200倍比稀释，分别每孔加100 μL，37℃孵育1 h，PBS′T洗涤5次后，每孔加入100 μL兔抗羊酶标二抗，37℃避光孵育1 h，PBS′T洗涤5次，每孔加100 μL TMB显色液，37℃避光显色30 min，加入50 μL终止液(2 mol/L浓硫酸)终止反应，10 min内在酶标仪上测定OD450 nm值。以阳性血清OD450 nm值在1.0左右，且P/N值(P为阳性血清孔平均值，N为阴性血清孔平均值)最大时为最佳的抗原包被浓度和血清稀释倍数。

利用相同方法对封闭时间(30、60、120 min)，血清与抗原反应时间(30、60、120 min)，酶标二抗稀释倍数(1∶1 000、1∶5 000、1∶100 000、1∶20 000)，血清与酶标二抗反应时间(30、60、120 min)，酶标二抗与底物TMB反应时间(15、30、45 min)等反应条件进行检测优化，根据阳性血清OD450nm值在1.0左右，P/N值最大确定最佳反应条件。

1.2.8 敏感性试验 将羊布鲁氏菌阳性血清分别做5、10、20、40、80、160、320、640倍稀释，依照上述建立的iELISA检测方法进行检测，评估建立的iELISA检测方法的灵敏度。

1.2.9 符合率试验 取从养殖场采集的100份血清样本，分别使用虎红平板凝集试验和所建立的iELISA方法进行检测，并对两种检测方法的结果进行对比。

2 结果

2.1 布鲁氏菌Omp16基因原核表达载体的构建

以B.suisS2菌株基因组为模板，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示，在507 bp处出现了一条与预期大小相符的特异性条带(图1)。将构建好的重组质粒进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测显示得到了一条与预期大小相符的507 bp的目的片段(图2)。阳性克隆质粒测序结果与GenBank上已公布的布鲁氏菌Omp16基因序列一致，且开放阅读框连接正确，表明重组原核表达载体构建成功。

M.DNA标准DL 1 000; 1.Omp16基因PCR产物M.DNA Maker DL 1 000; 1.PCR products of Omp16 gene

M.DNA标准DL 1 000; 1.pET32a-Omp16质粒PCR产物

2.2 重组蛋白OMP16的诱导表达、纯化及反应原性测定

将OMP16表达菌[大肠埃希氏菌BL21(DE3)]诱导后的表达产物经120 g/L的SDS-PAGE电泳检测，结果见图3，显示在约34 ku处出现了一条与预期大小相符的蛋白条带，表明重组蛋白OMP16成功表达。

经IPTG诱导后的菌液经超声裂解后，离心收集上清和沉淀，为保持重组蛋白的免疫活性，对上清中的可溶性蛋白进行纯化，12%的SDS-PAGE电泳结果显示获得了纯度较高的重组蛋白(图4)。Western blot鉴定分析纯化后的重组蛋白，分别用鼠抗6×His-tag(1∶3000)(图5)和羊布鲁氏菌标准阳性血清(1∶100)(图6)为一抗的结果显示，大约在34 ku处出现了一条特异性的免疫印迹条带，与预测的重组蛋白大小相符，而阴性对照没有出现特异性的免疫印迹条带，说明纯化后的蛋白即为带有6×His的Omp16融合蛋白，且纯化的融合蛋白能与羊布鲁氏菌标准阳性血清发生特异性的免疫反应，可用作ELISA的包被抗原。

M.蛋白分子质量标准；1.pET-32a未诱导；2.pET-32a诱导产物；3.pET32a-Omp16 未诱导；4.pET32a-Omp16 诱导产物

M.蛋白分子质量标准；1.pET32a-Omp16纯化产物

2.3 iELISA反应条件优化结果

根据方阵滴定法筛选iELISA最佳反应条件试验结果显示(表1)，当重组蛋白包被浓度为1 μg/mL，血清稀释10倍时，检测阳性血清的OD450nm值接近1.0，且此时P/N值最大。因此确定OMP16的最佳包被浓度为1 μg/mL，血清稀释10倍为最佳的血清稀释倍数。经过试验，确定最终的iELISA反应条件，即1 μg/mL的重组蛋白OMP16用pH 9.6的碳酸盐缓冲液在4℃温度条件下包被过夜，用50 g/L的脱脂奶粉37℃封闭1 h，加入10倍稀释的血清样本，在37℃条件下孵育1 h；酶标二抗做1 000倍稀释，在37℃条件下孵育1 h，TMB显示液避光显色30 min，最后用2 mol/L浓硫酸终止显色反应。

a.pET32a-Omp16未诱导；b.纯化的Omp16蛋白a.Not induced pET32a-Omp16；b.Purified protein of Omp16

a.pET32a-Omp16未诱导；b.纯化的Omp16蛋白a.Not induced pET32a-Omp16；b.Purified protein of Omp16

表1 最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数确定

2.4 临界值的确定

图7 阴性样品检测结果正态分布图

表2 iELISA敏感性试验结果

2.5 敏感性试验结果

用上述优化的iELISA方法检测不同倍比稀释的羊布鲁氏菌阳性血清(表2)，当羊布鲁氏菌阳性血清稀释80倍时，阳性血清的OD450nm低于临界值，说明其敏感性较好。

2.6 临床应用与符合率试验结果

分别使用虎红平板凝集试验和建立的iELISA方法对100份羊血清样本进行检测。结果显示，虎红平板凝集试验检出8份阳性和92份阴性，建立的iELISA方法检出11份阳性和89份阴性,显示建立的iELISA敏感性高于虎红平板凝集试验。iELISA与虎红平板凝集试验的阳性符合率为75.0%(6/8)，阴性符合率为94.6%(87/92)，总体符合率达到93%(93/100)，说明建立的iELISA方法与虎红平板凝集试验具有良好的一致性。

3 讨论

目前最常用的异源蛋白表达系统是原核表达系统，因其原核表达载体带有筛选和纯化标签，方便了蛋白的纯化。但原核表达载体系统也存在不足之处，会出现异源表达的蛋白与大肠埃希氏菌系统不相容，蛋白无法表达，以及表达的重组蛋白不可溶的现象[7]。本研究先后尝试了多种不同的载体，如pGEX-4T-1载体，pET-28a(+)载体，但均出现了重组蛋白未表达的现象。最终选用pET-32a载体，pET系统是目前E.coli表达重组蛋白最强大的系统。同时选用E.coliBL21(DE3)表达系统，因其遗传背景清楚，能高效表达具有生物学活性的蛋白分子[8]。同时，外源基因的高效表达也会受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等多方面因素的影响。试验中发现，在37℃诱导条件下，重组蛋白OMP16可溶性表达量较低，主要以包涵体的形式存在。经过多次试验验证，将诱导温度降低到22℃，诱导时间设定为8 h，重组蛋白可溶性的表达量显著增加。最终得到了大量纯度较高的可溶性重组蛋白OMP16, 经SDS-PAGE和 Western blot鉴定分析，该重组蛋白具有良好的反应原性，可用作iELISA的标记抗原。

布鲁氏菌病检测与诊断技术的研究和开发对于控制布鲁氏菌病的感染至关重要[9]。传统细菌学技术是诊断布鲁氏菌病的金标准，但细菌培养具有技术挑战性和危险性，需要熟练的技术人员来操作。因此在临床和兽医实验室中，需要使用灵敏、可靠和快速的诊断技术。目前国内普遍使用虎红平板凝集试验结合试管凝集试验进行布鲁氏菌病的检测和诊断，由于耶尔森氏菌等的抗原与布鲁氏菌存在交叉性，因此会造成假阳性结果。ELISA检测方法因结果稳定、准确率高、可批量检测等优势在生产实践中被广泛使用[10]。目前诊断布鲁氏菌病的ELISA技术主要以灭活菌体的LPS作为包被抗原，但革兰阴性菌的LPS具有较为明显的交叉反应，在临床应用中极易出现假阳性、假阴性的现象[11]。外膜蛋白是大部分革兰氏阴性菌重要的免疫原[12]。布鲁氏菌OMP16是布鲁氏菌第1组外膜蛋白，是布鲁氏菌外膜结构中必不可少的成分[13]。有研究表明，在敲除布鲁氏菌Omp16后，影响了外膜肽聚糖的连接，从而导致布鲁氏菌外膜结构受到破环，最终使得细胞因外膜通透性增加而溶解死亡[14]。同时，布鲁氏菌OMP16具有良好的免疫原性和保护性，它是一个不需要添加佐剂就能诱导机体产生与活疫苗S19相似保护水平的布鲁氏菌蛋白，能引起机体Th1特异性的免疫应答，同时还能够激活单核细胞，诱导产生炎性细胞因子[15-16]。布鲁氏菌OMP16是一种免疫原性蛋白，可刺激机体产出相应的抗体，因此，可以将该蛋白作为布鲁氏菌血清学检查的标记抗原。由于OMP16在免疫方面的显著优势，缺失Omp16基因的突变株作为一种疫苗成为了研究热点，建立基于布鲁氏菌OMP16的iELISA方法即可区分免疫和野毒株感染，从而可准确的淘汰野毒感染的家畜[17]。因此，布鲁氏菌OMP16作为抗原在临床诊断上具有重要的现实意义。

ELISA方法受多种因素的影响，首先是抗原抗体的反应条件。根据抗原抗体反应具有特异性、比例性、可逆性、阶段性等特点，采用方阵滴定法筛选抗原抗体最佳的反应条件。在验证本试验建立的iELISA检测方法与虎红平板凝集试验的符合率时，采集了100份未免疫羊场的羊血清，分别用建立的iELISA和虎红平板凝集试验(RBT)进行检测，结果显示，iELISA的阳性检出率略高于虎红平板凝集试验(11 vs. 8)，同时，血清稀释40倍仍能检出，提示iELISA具有较高的敏感性。进一步比较两者的符合率，显示两种检测方法的总体符合率达到93%，阳性符合率75.0%，阴性符合率为94.6%。出现阴性符合率高而阳性符合率低，可能是由于iELISA针对的是OMP16，特异性高，而虎红平板凝集试验特异性相对较低，同时，两者的敏感性也有差异所造成。另外，本试验所检测的样本数量较少，也是造成阳性符合率低的因素，需要进一步进行大量临床样本检测数据的比对和验证。总之，本试验建立的iELISA检测方法具有良好的灵敏度和符合度，具有应用于生产实践中布鲁氏菌病的检测的潜力，可为Omp16敲除疫苗的应用提供鉴别诊断方法。