基于重组致密颗粒蛋白11的弓形虫胶体金免疫层析检测方法的建立

张艳玲，孟庆玲*，乔 军，任宏琪，赵春光，宁程程，季春晖，才学鹏

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)

弓形虫病是由专性胞内寄生性原虫弓形虫感染机体所引起的人兽共患性疾病，对于免疫能力正常的成年人，弓形虫侵染机体一般无明显的临床症状；当机体免疫功能低下或有缺陷时，弓形虫可侵害其各个组织器官引起严重的临床症状，如弓形虫脑炎、眼病和心肌心包炎等，严重时可危及生命。妊娠期妇女感染弓形虫后可导致流产、胎儿畸形、死亡[1]。据统计，全世界健康人群弓形虫的感染率在7.5%～80%。美国、北欧和东南亚的患病率低于30%，而在非洲和拉丁美洲地区超过60%[2-3]。我国不同地区人群感染率为0.3%～47.3%，平均可达7.88%。随着我国宠物犬、猫的饲养量逐年增长，人类的感染情况也出现上升的趋势，人弓形虫抗体阳性率升至12.3%[4]。现阶段无可根治此病的药物。因此，开展弓形虫感染的检测方法研究对于该病的有效防控具有重要意义。目前市场上大多数商业血清学检测试剂盒使用的抗原是通过小鼠体内或组织培养获取的速殖子所制备的天然抗原，生产这些抗原的方法在不同的实验室之间难以标准化[5-6]。重组抗原利用基因工程和分子生物学方法获得重组抗原作为替代抗原来源，抗原成分确定，可选择的抗原多种多样，方法易标准化，根据选择的抗原，可以区分出急性感染和慢性感染两个阶段[7]。因此，本研究用基因工程方法获得重组蛋白，以此作为抗原，结合胶体金免疫层析技术，制备了弓形虫抗体检测试纸条，用于弓形虫病的诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、血清及试剂E.coliDH5α、E.coliBL21、pET32a(+)质粒，均由石河子大学动物科技学院寄生虫实验室保存，弓形虫阳性血清和标准阳性血清，中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠；2×PCR Mix、核酸限制性内切酶KpnⅠ、Hind Ⅲ，均购自TaKaRa公司；DNA Marker、T4 DNA Ligase 蛋白Marker，购自北京全式金公司；蛋白上样液和BSA，购自北京索莱宝公司；葡萄球菌A蛋白(SPA)、HPR兔抗犬IgG、兔抗犬IgG，均购自北京博尔西科技公司；胶体金溶液、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜(NC)、吸水垫、PVC底板，均购自上海金标生物科技公司。

1.1.2 主要仪器 小型离心机(Eppendorf，SG-800)，PCR仪(TC4000)，电热恒温水浴锅(DZKW-S-6)，稳定稳流电泳仪(DYY-6C)，琼脂糖水平电泳液(DYCP-31DN)，丙烯酰胺凝胶电泳槽(DYCP-31DN)，高压蒸汽灭菌锅(MLS-3780)，恒温摇床(ZHWY-2102C)，水平摇床(Ts-2)，制冰机(Bio-Rad)，超净工作台(BHC-1300A/B3)，全波长酶标仪(Thermo，MultiskanGO)，凝胶成像仪(Bio-Rad)，恒温培养箱(HIQ-X100)。

1.2 方法

1.2.1 GRA11基因抗原表位集中片段的筛选及合成 从GenBank数据库获悉弓形虫ME49株GRA11基因和蛋白质序列，通过ExPASy提供的程序ProtParam预测GRA11蛋白的分子质量、等电点、氨基酸组成等理化性质，在线预测跨膜区(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)并通过DNASTAR软件在线分析蛋白的抗原表位和二级结构，选取无跨膜区且抗原表位集中一段基因序列人工合成。

1.2.2 GRA11基因的PCR扩增 根据筛选出的GRA11基因片段，利用primer premier 5.0软件设计一对引物，并在上、下游分别加入保护性碱基和限制性酶切位点KpnⅠ与HindⅢ，上游5′GGGTACCATGGCTCAGCCGGACAC3′,下游5′CCC AAGCTTTTACGGTTTCAGTTCGTCTT3′,引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。用PCR方法扩增目的片段，反应体系(20 μL)：无菌去离子水9 μL，2×TaqMix 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL。反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。扩增产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的目的片段进行胶回收处理。

1.2.3 重组表达质粒构建和鉴定 对胶回收产物和质粒pET-32a(+)分别进行KpnⅠ与Hind Ⅲ双酶切，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收双酶切产物，加入T4 DNA连接酶4℃过夜连接。次日将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。次日挑取单菌落过夜培养后提取质粒，经双酶切初步鉴定后送北京华大基因公司进行测序。测序后将正确的质粒命名为pET-32a(+)-GRA11。

1.2.4 重组质粒的诱导表达及鉴定 将重组质粒pET-32a(+)-GRA11转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂于含氨苄青霉素的LB平板上，挑取单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基，加入IPTG(1 mmol/L)诱导表达。分别收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h时的菌液。将菌液离心，分离上清和沉淀，重悬沉淀进行SDS-PAGE电泳。以一抗为1∶200稀释的犬弓形虫阳性血清，二抗为1∶3 000稀释的HRP标记兔抗犬IgG，用Western blot方法进行免疫学反应原性分析，最后DAB显色拍照分析。

1.2.5 基于rGRA11胶体金的免疫层析方法的建立 取一排8孔可拆卸酶标板板条，每孔中加入200 μL的胶体金溶液，依次加入0.1 mol/L的K2CO3调节胶体金溶液pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。加入过量标记的SPA 20 μL，混匀室温静置10 min后加入100 g/L NaCl，每孔50 μL，充分混匀后静置20 min后用酶标仪检测OD525nm对应的数值，数值变化最小的管对应的pH确定为最佳标记pH；取一排8孔可拆卸酶标板板条，每孔加入200 μL胶体金溶液，调节至最佳pH后依次加入0.25、0.5、1.0、1.25、1.5、1.75、2 μg/mL的SPA，混匀后室温静置20 min，每管加入50 μL 100 g/L NaCl，混匀后室温静置20 min后，用酶标仪检测OD525nm对应的数值，数值变化最小的管对应的SPA 浓度确定为最佳蛋白标记量。参考杨升[8]文中方法制备金标液。然后选取硝酸纤维素膜，T线和C线分别用不同浓度的纯化的rGRA11蛋白包被和兔抗犬IgG包被，确定T线和C线最佳包被浓度。最后取出粘性底板PVC(聚乙烯氯化物)板，依次粘贴NC膜-吸水纸-金标垫-样品垫。NC膜位于PVC底板中央最底层，吸水纸位于PVC板上沿，吸水纸下沿覆盖NC膜；结合垫上沿覆盖NC膜1 mm～2 mm，样品垫上沿覆盖金标垫2 mm，下沿与 PVC板的下沿齐平，组装试纸条。

1.2.6 敏感性与特异性试验 将弓形虫标准阳性血清，按照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024进行倍比稀释后，取100 μL梯度稀释的阳性血清依次滴于同一批次的9个试纸条的样品检测端，确定检测出弓形虫病阳性血清的最高稀释度，从而确定其敏感性。

取新孢子虫(Nc)阳性血清、肝片吸虫(Fh)阳性血清、犬瘟热病毒(CDV)阳性血清、弓形虫(Tg)阳性血清，滴于所制备的同一批次试纸条检测端，3 min后观察检测结果，分析该方法的特异性。

1.2.7 符合性试验 用上述建立的rGRA11胶体金的免疫层析方法与商品化弓形虫间接血凝抗体检测试剂盒对119份犬临床血清样品进行检测，分析所建立rGRA11胶体金的免疫层析方法的特异性和敏感性以及与商品化弓形虫间接血凝抗体检测试剂盒检测结果的符合率。

2 结果

2.1 弓形虫GRA11基因合成与鉴定

PCR扩增结果显示，GRA11基因扩增产物在501 bp处有一条清晰的目的条带，与预期目的条带大小相符(图1)，证实成功得到了GRA11基因。

M.DNA标准DL 2 000; 1～2.GRA11基因扩增产物

2.2 重组质粒pET-32a(+)-GRA11双酶切鉴定结果

重组质粒pET-32a(+)-GRA11经KpnⅠ与Hind Ⅲ进行双酶切鉴定，得到约5 900 bp的载体片段和501 bp目的片段(图2)，与预期片段大小一致，证实GRA11基因已插入到pET-32a(+)载体中。

M.DNA标准DL 5 000; 1～3.重组质粒pET-32a(+)-GRA11双酶切

2.3 重组蛋白rGRA11的诱导表达、纯化及鉴定

SDS-PAGE分析显示，诱导后重组菌在36 ku处表达出了与预期蛋白大小相符的蛋白，而上清液中未检测到蛋白条带，证明rGRA11主要以包涵体的形式表达(图3)。经Ni2+-NTA柱纯化后，Western blot分析在约36 ku处检测到目的条带(图3)，证明表达的rGRA11能够与犬弓形虫阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。

2.4 胶体金溶液最佳标记pH与最佳蛋白标记浓度

用0.1 mol/L K2CO3调节每管胶体金溶液pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每管再加入SPA蛋白和NaCl溶液反应后，用酶标仪测定每管胶体金溶液所对应的OD值分别为0.452、1.059、0.990、0.342、0.351、0.358、0.362、0.375，结果显示pH为6.5时OD525nm数值变化最小，所以胶体金溶液最佳标记pH应为6.5。将每管胶体金溶液pH调至最佳，再于每管分别加入0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mg/mL不同稀释浓度的SPA蛋白和NaCl溶液反应后，测定每管胶体金溶液所对应的OD值分别为0.556、0.979、0.999、1.231、0.896、0.821、0.652、0.599，结果显示当加入的SPA浓度为0.75 mg/mL时OD525nm数值变化最小。所以胶体金溶液最佳蛋白标记浓度应为0.75 mg/mL。

M.蛋白分子质量标准; 1～4.重组菌诱导0、2、4、6 h; 5.重组蛋白rGRA11的Western blot鉴定

2.5 最佳检测线和质控线质量浓度的确定结果

用1.5、1、0.75、0.5、0.25 mg/mL梯度浓度的rGRA11在NC 膜检测线(T 线)处划线，用0.75、0.65、0.5、0.25、0.1 mg/mL在兔抗犬IgG在NC膜控制线(C线)处划线，当T线包被的蛋白浓度为1 mg/mL 时条带条带颜色明显且蛋白浓度最低，当C线包被的抗体浓度浓度为0.75 mg/mL时，条带颜色明显且抗体使用浓度最低(图4)。所以，胶体金试纸条的T线、C线最佳蛋白标记浓度分别为1 mg/mL和0.75 mg/mL。

2.6 敏感性与特异性试验

将犬弓形虫阳性标准血清倍比稀释至1∶1024，用同一批次的胶体金试纸条进行敏感性试验。当稀释至1∶512时仍可看到T线有轻微的条带，所以试纸条的敏感性为1∶512(图5)。

用同一批次的胶体金试纸条对Tg阳性标准血清、Nc阳性标准血清、Fh标准阳性血清和CDV标准阳性血清进行检测。Tg阳性标准血清T、C线均显色；Nc、Fh、CDV阳性标准血清T不显色，C线有颜色变化，表明试纸条特异性良好(图6)。

图4 检测线(T)质控线(C)抗体包被浓度的确定

2.7 临床血清样品的检测对比试验

用建立的rGRA11胶体金的免疫层析方法与商品化弓形虫间接血凝抗体检测试剂盒对119份犬临床血清样品进行检测。结果显示rGRA11胶体金的免疫层析方法检出阳性血清13份，商品化试剂盒检出阳性血清16份。rGRA11胶体金的免疫层析方法的敏感性=100.00%[13/(13+3)]=81.25 %，特异性=100.00%[103/(103+0)]=100%，两种检测方法的符合率为100%[(13+103)/(13+0+3+103)]=97.4%，表明该试纸条的准确性较高。

图5 胶体金试纸条的敏感性试验

图6 胶体金试纸条的特异性试验

3 讨论

弓形虫具有棒状体、微线体和致密颗粒三大细胞器，三者在弓形虫进入机体后定植时分泌一系列蛋白，提供营养物质和协助完成免疫逃避[9]。致密颗粒蛋白(GRAs)大多于弓形虫速殖子和缓殖子时期均可表达，可以抵抗宿主细胞溶酶体对弓形虫的攻击，在寄生性纳虫液泡(PV)的形成和成熟起着重要的作用[10-11]。同时，GRAs是一种具有良好抗原性的分泌蛋白，可以作为弓形虫感染诊断和疫苗研发的抗原。

近年来，弓形虫几十种蛋白基因被克隆到细菌和真核表达系统，包括表面抗原SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、SAG3 (P43)；致密颗粒蛋白抗原GRA1 (P24)、GRA2 (P28) 、GRA6 (P32)、GRA7 (P29)；棒状体抗原ROP1 (P66)、ROP2 (P54)[12]等。以大肠埃希氏菌为载体诱导表达的GRA7重组蛋白建立ELISA方法，通过检测了72份血清，其敏感性为68.9%[13]；以GRA2重组蛋白为抗原，建立ELISA方法检测了90份血清，敏感性为22.5%；建立GRA6和P35重组蛋白作为抗原的ELISA，检测57份血清中的IgG抗体，其敏感性分别为63.1%和54.5%；用纯化后的弓形虫表面抗原 SAG3 作为包被抗原对临床中96 份猫血清样品进行检测，结果与商品化间接血凝试剂盒进行对比，间接ELISA阳性率为61.46%(59/96)，间接血凝试剂盒的阳性率为56.25%(54/96)[14]；以P30作为检测抗原，制备出胶体金试纸条，分别用试纸条和己建立的双抗体夹心ELISA方法检测64份小鼠血清中的抗原，符合率达到93.8%[15]。可以看出所构建检测方法特异性与敏感性参差不齐，这主要取决于所包被的重组抗原。因此，开发更多标准化的纯化抗原尤为重要。

本研究前期对GRA11蛋白的结构、理化特性和B细胞免疫原性进行预测，通过抗原表位分析后，选取抗原表位高的基因序列构建原核表达载体，构建载体用时少，成本低，并成功诱导重组蛋白的表达。在成功的获得了高表达量的重组蛋白后，以纯化后的重组蛋白作为包被抗原，制备出免疫胶体金检测试纸条，通过检测临床上119份犬血清，并与市售的间接血凝检测试剂盒检测结果进行对比后，敏感性为81.25%，特异性为100%，两种方法的符合率达到97.4%。