抗鸡毒支原体与大肠埃希氏菌混合感染中药复方配比的优化

吴志勇，范倩倩，包佳鑫，李 睿，Muhammad Ishfaq，李继昌,2*

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.中国疾病预防控制和药物开发黑龙江省重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

呼吸系统疾病严重影响世界各地的家禽生产养殖业，造成了严重的经济损失[1]。当家禽出现呼吸系统疾病时，多是发生混合感染，常见的病原有鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)、大肠埃希氏菌(E.coli)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)等。家禽发生多种病原感染时，病因越复杂，被感染家禽的死亡率就越高[2-3]。近年来，随着集约化养殖的扩大，混合感染的威胁越来越大，然而用于混合感染治疗的药物研究的报道却很少。用前期实验室筛选的6味中药模型研究结果[4]，通过均匀试验的方法来优化这几味中药的最佳配比。均匀试验的步骤包括基于因素和水平的数量选择合适的均匀试验表，选择恰当的评分标准，建立回归分析[5]。用4个被广泛用于评估感染的指标，气囊和气管病变评分，MG和E.coli的最小抑菌浓度(MIC)[6-7]，将这4个指标经过归一化处理后汇总为总得分，作为中药复方有效性的最终指标。依据均匀分散在域上的试验设计点，利用DPS数据分析系统进行了多元非线性回归分析以求得最佳组合配比。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及菌株 1日龄未接种疫苗的商业来航鸡120只，购自哈尔滨光大养鸡场。MGR菌株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠，E.coliO78从本实验室大肠埃希氏菌病鸡中分离保存。整个试验过程严格消毒，确保动物无感染，饲喂的饲料为无抗雏鸡饲料。试验鸡适应性饲养至7日龄，试验前剔除过大、过小、体弱的雏鸡。

1.1.2 药品、试剂及耗材 6种中草药(包括板蓝根、连翘、桑白皮、银杏叶、甘草和丹参)购自哈尔滨市安国百草药材行；MH肉汤培养基，北京奥博生物科技有限公司产品；支原体无血清培养基，上海源培生物科技股份有限公司产品；胎牛血清，美国Gibco公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，瑞士Roche公司产品；青霉素溶液，哈药集团制药总厂产品；0.22 μm滤器，德国MilliPore公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 将MGR株用支原体完全培养基在37℃恒温培养箱下培养至1×109CCU/mL，将大肠埃希氏菌在MH肉汤培养基中培养至109CCU/mL。MG完全培养基：量取支原体无血清培养基40 mL，无菌胎牛血清10 mL，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸50 μL，青霉素溶液50 μL，混合均匀。放4℃冰箱保存备用。

1.2.2 药液制备 将板蓝根、连翘、桑白皮、银杏叶、甘草和丹参加水煎煮2次，每次加15倍重量水煎煮1 h，合并2次煎煮液后浓缩至终浓度为1 280 mg/mL，高速离心(8 000 r/min，15 min)取上清后，置于 4℃冰箱冷藏备用。进行MIC测定试验前用0.22 μm滤器对中药提取物进行过滤除杂。

1.2.3 动物分组及处理 用稀释好的支原体菌液，以0.2 mL/只的剂量注射7日龄鸡左胸腔气囊中。10日龄时，给鸡腹腔注射大肠埃希氏菌液0.1 mL/只。从第13天起，将120只鸡随机分为10组，用不同配比的中药复方治疗(A～J组)(表1)。通过灌胃给药的方式连续1周给予治疗组鸡450 mg/kg的剂量[8]。

表1 均匀试验设计表

1.2.4 MIC测定 MIC使用96孔板稀释技术测定，MG滴度为106CCU/mL。将0.1 mL的培养基添加到96孔板中，再将0.1 mL中药复方(1 280 μg/mL)添加到第1孔中。通过2倍稀释中药复方浓度(640 μg/mL～1.25 μg/mL)，并丢弃最后的0.1 mL。向每个孔中再补充0.1 mL制备好的MG等分试样，最终滴度为5×105CCU/mL。以上方法与大肠埃希氏菌的检测方法相同，每个浓度进行3次平行试验。

1.2.5.1 评价指标归一化处理与综合指标计算 采用最小-最大归一化方法来消除不同维度的影响。使用4个指标计算总分，包括MG和大肠埃希氏菌的MIC，气囊和气管病变得分，并使用公式(1)归一化处理这4个指标。根据公式(2)计算综合得分。

(1)

i代表样品序号；Ri是通过最小-最大归一化方法转换后的无量纲值；xi是第i个测量值，xmax是所有测量值的最大值，xmin是所有测量值的最小值。

D=∑0.25Ri

(2)

D代表综合评价指标；Ri是通过最小-最大归一化方法转换后的无量纲值。

1.2.5.2 呼吸系统疾病的评估规则 剖检样本时，为避免左侧气囊接种带来的影响，选择观察右侧胸部气囊，根据气囊损伤程度以5个等级对其进行评分[9]：0级：气囊正常，干净透明且薄，计0分；1级：气囊些许增厚和轻度浑浊，局部可见少数灰或黄色渗出物斑点，计1分；2级：部分气囊区域有可见的灰色和黄色渗出物，同时伴有中度增厚，计2分；3级：大片气囊布满黄色干酪样渗出物，计3分；4级：整个气囊布满黄色干酪样渗出物，气囊完全失去弹性，计4分。格罗斯气囊病变计分=所有鸡气囊损伤度总和/被检鸡数。气管病变评分由气管的相同3个横截断点确定。气管感染评分也是基于0到3评分系统计算[10]。 MG和大肠埃希氏菌的MIC分为10个倍比浓度的稀释液，范围从640 μg/mL～1.25 μg/mL。我们根据检测MIC的孔数定义结果，并根据公式(1)归一化处理。

2 结果

2.1 评估指标的实测数据

由于4个指标的维度不同且各指标代表不同意义，在进行多指标评估时很难进行全面的分析[12]。因此，每个评估指标的数据必须经过无量纲化处理(表2)。

2.2 均匀试验回归分析的最佳组合

用均匀设计来调节中药配比，进一步将感染鸡的治疗效果与多指标分析相结合。6因素分别为板蓝根(x1)、连翘(x2)、银杏叶(x3)、桑白皮(x4)、甘草(x5)和丹参(x6)。综合评价分数作为因变量，由y表示。多元二次方程由DPS建立：y=-223.2+57.8×x2+0.5×x4+46.4×x5+0.1×x12-2.9×x22-2.0×x52+0.002×x2×x3-4.1×x2×x5，R2=0.999 998，F值=62 499.906 3，回归显着性检验(P=0.003 1)。结果表明，该比例为14∶7∶11∶12∶5∶3，具有最佳的治疗效果。DPS的所有分析结果均记录在补充材料中。

表2 4种评价指标结果及相应归一化处理后分数与总分

3 讨论

中药复方防治鸡毒支原体与大肠埃希氏菌混合感染有潜在的优势。鸡毒支原体感染病鸡的肺组织的病变、坏死及咳喘等症状是邪实的表现，病鸡抵抗力降低，导致机体正气受损，据此本病应属虚证范畴的正虚邪实证[13]。中药复方具有成份复杂和多靶点的特点，通过扶正祛邪，以增强动物免疫力，当免疫细胞大量吞噬病原体后，使机体恢复平衡而达到药到病除的目的[14]。另外，复方中药还对鸡大肠埃希氏菌感染时产生的内毒素具有直接或者间接杀灭及清除作用，对动物机体整体起多向调节作用[15]。不同于抗生素和化学合成药物，中药成分均为生物有机物，其毒副作用小是中药发展的优势，并且还具有低残留的特点[16]。本研究所用6味中药为本实验室根据网络药理学的方法反向筛选出来的新中药组合物，包括6味中药，分别是板蓝根、连翘、桑白皮、银杏叶、甘草和丹参。

通过回归分析得到了多元二次方程。该方程可以很好地拟合每味中药对总分的影响，表明板蓝根、桑白皮和甘草与混合感染鸡的综合指标总分具有正相关的关系，其中板蓝根对总分的影响最大。本中药组合物一方面能抑制鸡毒支原体和鸡致病性大肠埃希氏菌生长，另一方面配伍具有润肺止咳、清热解毒、镇痛抗炎等功效。诸药配合，发挥清热解毒、润肺止咳之功效，标本兼治，达到防治效果。

本研究采用均匀试验设计对中药的不同组合进行优化，并根据综合指标进行了多元二次回归，新中药复方中板蓝根、连翘、银杏叶、桑白皮、甘草和丹参的比例为14∶7∶11∶12∶5∶3，具有最佳的治疗效果。该方法为进一步开发现代中药和对禽类呼吸系统疾病进行综合评价提供了依据。