组蛋白去乙酰化酶2在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义

陈仲林丽燕 程变巧 林仁河 蒋小玲

作者单位：350007 福州 1厦门大学附属福州第二医院神经内科；350014 福州 2福建医科大学附属肿瘤医院，福建省肿瘤医院病理科；350007 福州 3厦门大学附属福州第二医院肝胆内科

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝脏最常见的恶性肿瘤，全球每年新发肝癌病例约840 000例，死亡病例约780 000例［1-2］。手术、肝移植、化疗、局部放疗等是治疗肝癌的主要措施，但肝癌起病隐匿且尚缺乏特异性的早期检测指标，大部分患者确诊时已处于晚期，失去手术治疗机会，预后不良［3］。索拉非尼是晚期肝癌患者的主要治疗药物，可以显著延长中位生存期，但治疗后期常出现药物耐受，且费用昂贵［4］。因此亟需探寻可应用于肝癌早期诊断、反映疾病预后的指标及开发新的治疗手段。

组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）是表观遗传学中组蛋白修饰的重要蛋白酶，对染色体结构修饰和基因表达调控具有重要作用，在多种肿瘤中异常表达，并可促进肿瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡、促进血管增生［5-6］。HDAC抑制剂（inhibitors of HDACs，HDACi）也是具有前景的抗肿瘤治疗手段。但是HDACi在靶向特定酶方面尚缺乏特异性，可能导致广泛的副作用。因此，在HCC组织中确定具有应用前景的HDACs类型，进而开发新的靶向治疗药物具有重要的临床意义。本研究通过检测人HCC组织中组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）的表达情况，探讨其表达水平与HCC患者临床病理学参数及预后的关系，为寻找新的HCC预后标志物和治疗靶点提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2011年1月至2013年12月于厦门大学附属福州第二医院确诊并行根治性切除术的142例HCC患者为研究对象，收集癌和癌旁组织（距肿瘤边缘1 cm以上）石蜡样本，所有患者均有完整的临床病理资料。收集2018年6月至2018年10月手术切除的配对新鲜HCC组织及癌旁组织8例，离体后30 min内置于-70℃冰箱内保存，作为后续蛋白提取。所有患者均经术后组织病理学诊断为HCC，术前均未接受化疗、放疗等辅助治疗。本研究经厦门大学附属福州第二医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 Western blot实验检测HDAC2蛋白表达

分别取100 mg新鲜HCC及癌旁组织，加入RIPA裂解液提取组织蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，加入制备好的SDS-PAGE上样缓冲液，经电泳、转膜后，置于脱脂牛奶中室温封闭2 h，孵育稀释的一抗HDAC2（稀释比例1∶1 000，购自美国Abcam公司），4℃过夜，TBST洗膜后，室温孵育辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗β-actin（稀释比例1∶2 000，购自美国Abcam公司）2 h，经ECL荧光底物反应后，胶片曝光显影，扫描灰度。目的蛋白与内参灰度的比值即为目的蛋白的相对表达量。

1.3 免疫组化检测HDAC2蛋白表达

1.3.1 免疫组化染色 采用EliVision plus两步法对HCC石蜡组织样本中的HDAC2蛋白进行免疫组化分析。所有石蜡切片常规烤片、脱蜡、水化后，用柠檬酸热修复法进行抗原修复，3%过氧化氢封闭20 min阻断内源性过氧化物酶，滴加稀释的一抗HDAC2（1∶100），37 ℃湿盒内孵育 1 h，PBS 洗涤后加入试剂A（增强剂），37℃湿盒内孵育20 min；PBS洗涤后加入二抗（酶标羊抗鼠/兔聚合物），37℃湿盒孵育30 min；PBS再次充分洗涤后DAB显色，苏木素复染1 min，1%盐酸酒精分化3 s，冲水返蓝10 min梯度酒精、二甲苯脱水，切片风干后用中性树胶封片。采用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 免疫组化结果判读 免疫组化结果由2位病理科医师进行双盲阅片、评定。按染色强度和阳性细胞比例综合评分。HDAC2蛋白阳性定位在细胞核上。染色强度评分定义：无色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞数比例评分在400倍视野下按阳性细胞数比例评定：0分为无阳性细胞；1分为阳性细胞比例＜25%；2分为阳性细胞比例为26%～50%；3分为阳性细胞比例为51%～75%；4分为阳性细胞比例＞75%。最终结果由染色强度评分和阳性细胞数比例评分的乘积判定，0～4分为定义低表达，＞4分为高表达。

1.4 TCGA数据库检索策略

检索 Ualcan网站（http：//ualcan.path.uab.edu）基于TCGA数据库的HCC组织及癌旁组织中HDAC2 mRNA的表达情况及与预后的关系。

1.5 随访

术后开始随访，通过查询就诊记录及电话随访，每3个月随访1次，随访起止时间为2011年1月至2018年4月。无随访资料患者21例，随访期间，失访7例，随访率为94.2%。总生存期定义为从手术当日至患者死亡或末次随访的时间。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。HCC癌组织与癌旁组织中HDAC2蛋白的表达比较采用配对t检验。HDAC2蛋白表达水平与HCC患者一般临床资料的关系采用χ2检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，用Log-rank检验生存分析，多因素Cox回归探讨可能影响患者总生存期的独立预后因素，计算风险比（HR）及其对应的95%可信区间（CI）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HDAC2在HCC组织和癌旁组织中的表达

检索TCGA数据库结果显示，在HCC组织（n=371）中HDAC2 mRNA的表达高于正常肝组织（n=50）（P＜0.001），见图 1A。Western blot检测结果显示，HDAC2蛋白在8例HCC组织中的表达高于相应癌旁组织（P=0.025），见图1B。免疫组化检测结果显示，HDAC2蛋白主要定位于细胞核上，染色呈棕黄色，在癌组织中的表达也高于癌旁组织，见图2。

图1 HDAC2在HCC及癌旁组织中的表达Fig.1 Expression of HDAC2 in HCC and normal tissues

图2 HDAC2在HCC及癌旁组织中的表达（EliVisionplus，×200）Fig.2 Expression of HDAC2 in HCC and normal tissues(EliVision plus,×200)

2.2 HCC组织中HDAC2蛋白表达水平与临床病理特征的关系

在142例HCC组织中，HDAC2蛋白高表达率为81%（115/142），低表达率为19%（27/142）。HDAC2 蛋白表达与肿瘤分化程度、脉管侵犯及复发相关（均P＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、包膜侵犯及肝硬化无关（均P＞0.05），见表1。

表1 HDAC2蛋白表达水平与HCC患者临床病理特征的关系（n=142）Tab.1 Relationship between HDAC2 expression level and clinicopathological charactersitics of HCC patients（n=142）

2.3 HDAC2表达与HCC预后的关系

TCGA数据库显示，HCC组织中HDAC2 mRNA高表达患者预后较差（P＜0.001），见图3A。121例HCC患者中，Kaplan-Meier单因素分析结果显示，HDAC2蛋白高表达患者1年、3年及5年生存率分别为75.5%、29.8%、5.3%，中位生存期为38个月；低表达患者1年、3年及5年生存率分别为100.0%、96.3%、44.4%，中位生存期为58个月。Log-rank检验显示，HDAC2高表达组患者总生存期低于低表达组，差异有统计学意义（χ2=19.245，P＜0.001），见图 3B。

图3 HDAC2高表达与低表达HCC患者的生存曲线өFig.3 Survival curves of HCC patients with high and low expression of HDAC2

2.4 影响HCC患者术后总生存期的Cox回归分析

121例HCC患者中，单因素Cox回归分析显示，HDAC2蛋白高表达、肿瘤分化程度及脉管侵犯与HCC患者术后不良预后有关。多因素Cox回归分析显示，HDAC2高表达是HCC患者术后预后不良的独立危险因素（HR=12.255，95%CI：2.865～52.411），见表2。

表2 Cox回归分析影响HCC患者术后总生存期的因素Tab.2 Cox analysis to identify the prognostic factors affecting postoperative overall survival in HCC patients

3 讨论

HDACs通过使组蛋白N-末端的赖氨酸残基去乙酰化，促进组蛋白八聚体与带负电荷的DNA紧密结合，进而限制转录因子与RNA聚合酶Ⅱ结合，从而抑制基因转录［7］。HDACs分为4个亚家族，常受转录调节因子招募，通过失活抑癌基因启动子，抑制抑癌基因活性，在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用［8-9］。HDAC2属于Ⅰ型组蛋白去乙酰化酶家族成员，研究表明，HDAC2可以通过干扰肿瘤抑制基因p21位于启动子区域内的特异性蛋白1（Sp1）结合位点而抑制基因的活性［10］。HDAC2还可与SIN3形成复合物，与E-cadherin启动子结合后，抑制 E-cadherin表达，并促进 MMP表达和肿瘤侵袭［11］。HDAC2通过抑制p53和促进MYC表达还能抑制细胞凋亡和促进细胞周期进程［12-13］。在肝癌细胞中上调HDAC2表达后可抑制microRNA-449表达，并通过抑制C-MET mRNA表达促进细胞增殖，诱导细胞凋亡［14］。由此可见，HDAC2在肿瘤增殖和侵袭中具有重要作用。

LER团队在东南亚人群的研究结果显示，HDAC2在HCC中高表达［15］。也有研究报道HDAC2高表达是HCC患者预后不良的危险因素［16］。进一步通过Ualcan网站检索TCGA数据库，结果也发现，在HCC组织中HDAC2 mRNA的表达显著高于正常肝组织。本研究通过Western blot检测8例新鲜HCC组织和配对癌旁组织中HDAC2的表达，同样发现HCC组织中HDAC2表达高于癌旁组织，免疫组化检测结果也进一步证实了HDAC2在癌组织中高表达。HDAC2蛋白表达与HCC患者临床病理特征关系的分析结果显示，HDAC2蛋白在中低分化HCC组织中的表达高于高分化组，提示HDAC2表达可能与HCC增殖相关。此外，HDAC2表达还与脉管侵犯及复发有关，提示HDAC2也可能与肝癌侵袭及进展密切相关。进一步分析HDAC2表达与预后的关系，TCGA数据库显示，HCC组织中HDAC2 mRNA高表达的患者预后较差。临床样本的Kaplan-Meier分析显示HDAC2高表达患者的总体生存期缩短，多因素Cox回归分析结果证实HDAC2高表达是HCC患者术后预后不良的危险因素，说明HDAC2在HCC中具有重要的意义，靶向HDAC2可能是HDACi药物研究的新方向。

综上所述，HDAC2在HCC组织中高表达，并与肿瘤进展及不良预后相关，可能是HCC患者预后判断标志物及潜在的治疗靶点。