Ghrelin阳性细胞在食蟹猴消化系统中的分布定位

孙翠翠 宋尚桥 马围围 郑 福 曾素先 李 鑫 严 瑾 黎宗强*

(1.广西大学动物科学技术学院，南宁，530005；2.南宁市江南区沙井街道办事处水产畜牧兽医站，南宁，530033)

Ghrelin最早是由日本科学家Kojima[1]等人于1999年从大鼠胃组织中提取得到的一种含28个氨基酸残基的多肽。Ghrelin是一种脑肠肽[2]，主要分布在动物的消化系统、中枢系统中，周围组织如心脏、肾脏、睾丸、卵巢等也有分布。消化系统中的ghrelin阳性细胞主要集中在胃[3]，肠道中也被发现分布于十二指肠、空肠、回肠和结肠，且从十二指肠往后分布浓度逐渐减低；肝、胰腺等消化腺中也有少量分布。研究发现，ghrelin除了能调节GH的分泌，还能参与调节摄食与能量代谢，促进胃肠功能等多种生物学作用[4-6]。本研究通过免疫组织化学技术系统观察研究ghrelin在成年食蟹猴(Macacafascicularis)消化系统中的分布定位情况，为进一步阐明ghrelin在食蟹猴消化系统中的生理功能提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周岁成年雄性食蟹猴1只，由广西合法正规养猴场提供。

1.2 实验试剂

一抗为兔抗人ghrelin的多克隆抗体(ab87484，abcam)，购自广西南宁科赞生物科技有限公司；山羊抗兔SABC免疫组化染色试剂盒(SA1022)、DAB显色试剂盒(AR1022)均购自武汉博士德生物公司；多聚赖氨酸(P2100)、苏木素染色液(G1140)均购自北京Solarbio公司。

1.3 组织取材与固定

将食蟹猴按0.3 mg/kg进行速眠新臀部肌肉注射麻醉，分离出一侧颈动脉，剪开一个“V”形小口放血，待血液放掉大约1/3后，用生理盐水从颈动脉进行灌注冲洗，同时将同侧颈静脉也剪开，待颈静脉流出的液体呈清亮透明时，再换用4%中性多聚甲醛灌注固定，直至触摸动物的四肢及腹部内脏僵硬为止。然后对灌注后的动物进行组织取材，将采集到的样品继续置于4%中性多聚甲醛溶液里进行固定12—24 h，4 ℃冰箱中保存。

1.4 制作石蜡切片

取出固定完全的组织，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片，隔5取2。分为两组，一组用作免疫组化染色，另一组用作阴性对照。

1.5 免疫组化SABC法操作流程

切片常规脱蜡至水；热修复抗原：将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲液中，微波炉加热至沸腾后调至低档保持10 min，断电，室温冷却后，PBS浸洗2 min×3次；封闭内源性过氧化氢酶：3% H2O2室温孵育10 min，PBS浸洗2 min×3次；滴加5% BSA封闭液：37 ℃孵育30 min，甩去多余液体，不洗；滴加一抗(用PBS将一抗1∶1 000稀释)，4 ℃过夜，PBS浸洗2 min×3次；滴加二抗：37 ℃孵育1 h，PBS浸洗2 min×3次；滴加试剂SABC：37 ℃孵育30 min，PBS浸洗5 min×4次；DAB显色5—10 min；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察并拍照。阴性对照组用PBS代替一抗，其余步骤同上。

1.6 图像采集及统计分析

2 结果

2.1 Ghrelin阳性细胞在消化系统中的分布定位

免疫组化结果表明，ghrelin阳性细胞在食蟹猴的胃、十二指肠、空肠、胰腺中均有分布(图1：1—14)。Ghrelin阳性细胞在胃中分布最多，其定位于黏膜层内，从胃腺的颈部至底部均有分布，其中以底部居多(图1：1)。肠道中，ghrelin阳性细胞主要分布在十二指肠至空肠中段，其含量要少于胃，且分布浓度由前至后逐渐降低(图1：6—10)。肠道中的ghrelin免疫阳性细胞主要分布黏膜层的小肠腺中，少量分布于肠绒毛上。在十二指肠段，也可散在分布于十二指肠腺中(图1：8)。此外，胰腺中也有少量ghrelin免疫阳性细胞存在，主要分布于胰腺的内分泌部、腺泡、小叶内导管和小叶间导管周围(图1：11—14)。对照组实验仅见淡染的背景色，未见有阳性细胞分布(图1：15)。在消化系统的其他组织中，如口腔、咽、食管、空肠后端至直肠、肝脏、唾液腺等均未发现有ghrelin免疫阳性细胞的存在。

2.2 Ghrelin阳性细胞在消化道系统不同部位的分布特点

由上述研究结果可知，ghrelin阳性细胞在消化系统中分布于胃的贲门腺区、胃底腺区、幽门腺区，十二指肠，空肠前段和中段以及胰腺中，其他部位则未发现ghrelin阳性细胞分布。图像放大400倍单位视野面积下，各阳性区域中ghrelin阳性细胞分布特点如下。

2.2.1 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中分布数量的比较分析

由表1可知，单位视野面积下，ghrelin阳性细胞在胃的贲门腺区、胃底腺区及幽门腺区分布数量分别为4.78±1.09、14.11±3.52、4.89±1.69个，十二指肠、空肠前段及中段的分布数量分别为3.33±1.12、1.78±0.44、1.22±0.44个，胰腺中ghrelin阳性细胞的分布数量为1.11±0.33个。

如图2所示，在消化系统中，ghrelin阳性细胞在胃底腺区中的分布数量最高，与其他组织部位的差异均极显著(P<0.01)。贲门腺区和幽门腺区的分布数量也较高，且幽门腺区稍高于贲门腺区，二者在统计学上差异不显著(P>0.05)。肠道中的ghrelin阳性细胞分布数量比胃少，且从十二指肠往后逐渐降低。十二指肠与贲门腺区的差异不显著(P>0.05)，与幽门腺区和空肠前段差异显著(P<0.05)，与空肠后段和胰腺差异极显著(P<0.01)。空肠前段的分布数量与胃的三大腺区差异均极显著(P<0.01)，与空肠后段和胰腺差异不显著(P>0.05)。空肠后段和胰腺的分布数量接近，二者与其他组织部位的差异均极显著(P<0.01)。

分布部位Tissues阳性细胞数Numbers of positive cells平均直径/μmDiameter mean平均光密度Density mean阳性细胞面积/μm2Cells area占单位视野面积百分比/%Percentage贲门腺区Cardiac gland4.78±1.09Bab7.99±0.71BCbc0.52±0.05Bab242.28±57.10BCb0.39±0.09BCb胃底腺区Fundus gland14.11±3.52A7.94±0.50BCbc0.54±0.04Bab714.55±152.62A1.16±0.23A幽门腺区Pyloric gland4.89±1.69Ba9.13±0.80Ba0.57±0.08Ba323.71±120.08Ba0.52±0.19Ba十二指肠Duodenum3.33±1.12BCb8.51±0.89BCab0.55±0.05Bab186.37±55.48CDb0.30±0.09CDb空肠前段Anterior segment jeju-num1.78±0.44CDc8.13±0.93BCbc0.51±0.03Bb95.32±33.71DEc0.15±0.06DEc空肠中段Middle segment jejunum1.22±0.44Dc7.42±0.70Cc0.36±0.07C51.54±13.70Ec0.09±0.04Ec胰腺Pancreas1.11±0.33Dc10.19±1.41A0.67±0.06A89.77±24.04DEc0.14±0.04DEc

注：组间比较，小写字母不同为差异显著P<0.05；大写字母不同表示差异极为显著P<0.01

Note：Different small letter indicated significant different(P<0.05)，while different capital letter indicated extremely significant(P<0.01)compared between groups

图1 Ghrelin免疫阳性细胞在食蟹猴消化系统中的分布定位Fig.1 Ghrelin immunoreactive cells distribution and localization in cynomolgus monkey digestive systemA封闭型细胞Closed cell；B开放型细胞Open cell；←阳性细胞Positive cells。1.贲门腺区Cardiac gland(×100)；2.贲门腺区胃黏膜上皮Gastric epithelium from the cardia gland(×400)；3.贲门腺区Cardiac gland(×400)；4.胃底腺区Fundus gland(×400)；5.幽门腺区Pyloric gland(×400)；6.十二指肠小肠腺Duodenal small intestinal gland(×400)；7.十二指肠肠绒毛Duodenal villi(×400)；8.十二指肠腺Duodenal gland(×400)；9.空肠小肠腺Jejunal small intestinal gland(×400)；10.空肠肠绒毛Intestinal villi(×400)；11.胰腺内分泌部Pancreatic endocrine department(×400)；12.胰腺腺泡Pancreatic acini(×400)；13.胰腺小叶内导管Intralobular catheter of the pancreas(×400)；14.胰腺小叶间导管Pancreatic interlobular duct(×400)；15.对照组The control group(×400)

图2 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中分布数量的比较分析Fig.2 Comparison analysis of the numbers of ghrelin positive cells in different tissues

2.2.2 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中平均直径的比较分析

由表1可知，单位视野面积下，ghrelin阳性细胞在贲门腺区、胃底腺区和幽门腺区的平均直径分别为(7.99±0.71)μm、(7.94±0.50)μm、(9.13±0.80)μm，十二指肠、空肠前段和中段的平均直径分别为(8.51±0.89)μm、(8.13±0.93)μm、(7.42±0.70)μm，胰腺中的ghrelin阳性细胞平均直径大小为(10.19±1.41)μm。

由图3所示，幽门腺区的ghrelin阳性细胞直径大于其他两个腺区，且差异显著(P<0.05)。贲门腺区与胃底腺区细胞大小接近，差异不显著(P>0.05)。肠道中的ghrelin阳性细胞直径从十二指肠往后逐渐降低。十二指肠中的细胞直径小于幽门腺区，但大于另外两个腺区，其与三大腺区在统计学上均差异不显著(P<0.05)。空肠前段的ghrelin阳性细胞直径小于幽门腺区和十二指肠，但大于贲门腺区、胃底腺区和空肠中段。其与幽门腺区差异显著(P<0.05)，与消化道的其他部位均差异不显著(P>0.05)。空肠中段的ghrelin阳性细胞直径最小，其与幽门腺区差异极显著(P<0.01)，与十二指肠差异显著(P<0.05)，与贲门腺区、胃底腺区和空肠前段差异不显著(P>0.05)。胰腺中的ghrelin阳性细胞直径比消化道的大，其与消化道各段相比，差异均极显著(P<0.01)。

2.2.3 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中平均光密度值的比较分析

由表1 可知，单位视野面积下，贲门腺区、胃底腺区和幽门腺区的ghrelin阳性细胞光密度值(OD值)分别为0.52±0.05、0.54±0.04、0.57±0.08，十二指肠、空肠前段和中段的OD值分别为0.55±0.05、0.51±0.03、0.36±0.07，胰腺中的ghrelin阳性细胞OD值为0.67±0.06。

由图4所示，在消化系统中，空肠中段的ghrelin阳性细胞OD值最小，其与消化系统的其他区域差异均极显著(P<0.01)。胰腺中的ghrelin阳性细胞OD值最大，也与消化系统的其他区域差异均极显著(P<0.01)。在胃组织中，幽门腺区的ghrelin细胞OD值>胃底腺区>贲门腺区，但3个区域在统计学上无显著差异(P>0.05)。肠道中的ghrelin阳性细胞OD值从十二指肠往后逐渐降低。十二指肠的细胞OD值低于幽门腺区，但均高于消化道的其他组织，其与三大胃腺及空肠前段差异均不显著(P>0.05)。空肠前段的阳性细胞OD值与幽门腺区差异显著(P<0.05)，与贲门腺区、幽门腺区及十二指肠差异均不显著(P>0.05)。

2.2.4 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中所占单位视野面积百分比的比较分析

由表1可知，单位视野面积下，ghrelin阳性细胞在贲门腺区、胃底腺区、幽门腺区所占的面积百分比分别为(0.39±0.09)%、(1.16±0.23)%、(0.52±0.19)%，在十二指肠、空肠前段和中段所占比例为(0.30±0.09)%、(0.15±0.06)%、(0.09±0.04)%，在胰腺中所占比例为(0.14±0.04)%。

图3 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中平均直径的比较分析Fig.3 Comparison analysis of the diameter of ghrelin positive cells in different tissues

图4 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中平均光密度值的比较分析Fig.4 Comparison analysis of the OD value of ghrelin positive cells in different tissues

如图5所示，单位视野面积下，ghrelin阳性细胞所占的面积百分比在胃底腺区最高，其与消化系统的其他组织相比差异均极显著(P<0.01)。贲门腺区和幽门腺区的面积百分比也较高，且幽门腺区高于贲门腺区，二者差异显著(P<0.05)。肠道中的ghrelin阳性细胞面积百分比从十二指肠往后逐渐降低。十二指肠中的面积百分比低于三大胃腺，其与贲门腺区差异不显著(P>0.05)，与空肠前段差异显著(P<0.05)，与胃底腺区、幽门腺区和空肠中段差异均极显著(P<0.01)。空肠前段与胰腺的面积百分比接近，二者与三大胃腺差异极显著(P<0.01)，与十二指肠差异显著(P<0.05)，与空肠中段差异不显著(P>0.05)。空肠中段的面积百分比在整个消化系统中最低，其与三大胃腺及十二指肠差异极显著(P<0.01)，与空肠前段和胰腺差异不显著(P>0.05)。

图5 Ghrelin阳性细胞在不同组织结构中所占单位视野面积百分比的比较分析Fig.5 Comparison analysis of the percentage of the unit field area of ghrelin positive cells in different tissues

3 讨论

3.1 Ghrelin阳性细胞在消化系统中的分布定位

Ghrelin最早是从大鼠胃组织中分离得到的[1]，它是一种具有刺激摄食和促进GH释放的多肽，在人和大鼠的研究中表明，ghrelin在胃肠道和中枢神经系统均有分布，属于一种脑肠肽[2]。胃肠道是ghrelin的主要来源，其中胃组织中ghrelin的含量最高，约占总体的20%[7]。本研究结果表明，ghrelin阳性细胞在食蟹猴消化系统中主要分布在胃组织中，与此结果保持一致。肠道中的ghrelin阳性细胞只分布在十二指肠、空肠前段和中段，空肠后段到直肠间的各段肠管则未见分布。而有研究表明，在青紫蓝家兔(Oryctolaguscuniculus)[8]的十二指肠到直肠均有ghrelin阳性细胞分布；在山羊[9]的胃肠道中，ghrelin阳性细胞主要分布在皱胃、十二指肠到结肠段。这些结果均与本研究结果存在一定的差异。已有多项研究表明，ghrelin及其受体在啮齿类动物和人的胰腺中也有少量表达[10-11]，这一研究结果与本研究一致。本研究还发现ghrelin阳性细胞在食蟹猴的口腔黏膜、食管及肝脏中没有表达，而在其他物种，如大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)[12]、鸡[13]、鱼[14]等的肝脏组织中则均有表达。

3.2 Ghrelin阳性细胞在消化系统不同部位分布定位和含量的特点

Date等[7]通过原位杂交证实，表达Ghrelin mRNA的细胞主要分布于胃底黏膜泌酸腺的体部和底部，肠道中的ghrelin细胞主要分布于肠腺上皮及肠绒毛上皮内。Sakata等[3]发现，大鼠胃组织中的ghrelin细胞主要存在于胃底腺的体部和底部，少量分布于胃底腺的颈部。肠道中的ghrelin细胞主要存在于肠腺上皮中，少量分布于肠绒毛上皮之中。

本研究结果表明，ghrelin免疫阳性细胞在食蟹猴胃中主要分布于胃腺的体部和底部，少量分布于腺体颈部和黏膜上皮中。肠道中的ghrelin阳性细胞分布浓度比胃低，且从十二指肠往后逐渐降低，其主要分布于小肠腺和肠绒毛上皮中，此外，在十二指肠腺中也发现有少量阳性细胞分布。这些研究结果均与大鼠[7]、鸵鸟(Struthiocamelus)[15]、兔[16]、鹅[17]等研究结果保持一致。

Ghrelin免疫阳性细胞在胰腺中的分布也有大量研究，Date等[18]最先报道，ghrelin可存在于成年大鼠和人的胰岛α细胞中，Volante等[19]认为ghrelin只在胰岛β细胞中表达。Wierup等[20]则认为在胎儿、新生儿和成人胰岛内均有ghrelin的表达，其中在胰岛中表达ghrelin的细胞不是胰岛α细胞，而是一种新类型的胰岛内分泌细胞。这种细胞在成人胰岛内呈单个分布在胰岛周围，少量分布于胰腺外分泌部、导管和胰腺神经节等处。Prado等[21]将小鼠胰岛内分泌ghrelin的新型内分泌细胞按目前胰岛细胞命名法，将其称之为“ε细胞”。方富贵等[22]报道，在皖西白鹅胰腺的外分泌部和内分泌部均有ghrelin表达，外分泌部表达ghrelin的阳性细胞为腺泡细胞，内分泌部细胞胞质中均可表达ghrelin。阳性细胞在胰腺的分布不均，内分泌部数量比外分泌部多。

本研究表明，胰腺中的ghrelin免疫阳性细胞在外分泌部和内分泌部均有分布，细胞呈单个存在。外分泌部的细胞主要分布在腺泡、小叶内导管和小叶间导管附近，且外分泌部的含量比内分泌部多，这一结论与Wierup等[20]在人类中的研究结果相一致，与方富贵等[22]在皖西白鹅中的研究存在一定的差异。提示ghrelin阳性细胞在胰腺中的分布存在种属差异。

3.3 Ghrelin阳性细胞在消化系统不同部位的细胞形态特征

Sakata等[3]发现胃肠道内的ghrelin阳性细胞根据其游离面是否到达腔面，可分为“开放型”和“封闭型”。开放型细胞多呈三角形或长条形，细胞顶端到达腺体腔面；封闭型细胞多小而圆，胞质顶端未到达腺体腔面。胃中主要为封闭型，肠道中存在封闭型和开放型两种类型。魏凤梅等[13]报道，在鸡腺胃腺小叶基底部的ghrelin阳性细胞胞体呈小球形，少数呈长条形，胞核圆形或卵圆形，细胞多为封闭型。小肠腺中的阳性细胞胞体呈球形或三角形，胞核圆而透亮；肠粘膜上皮中阳性细胞多呈长条形，胞核浅染，胞质染色较深。因此肠道中均含有封闭型和开放型两种细胞，且从十二指肠往后封闭型的比例逐渐降低。

本研究结果表明，食蟹猴胃肠道内的ghrelin细胞形态多样。胃中ghrelin阳性细胞多呈圆形、卵圆形，少量呈梭形、锥体形及其他不规则形，其主要为封闭型细胞(图1：2A)。在肠道中，小肠腺上皮中的阳性细胞多为卵圆形、锥体形，肠绒毛上皮中的阳性细胞多为锥形、长条形。十二指肠中存在封闭型和开放型两种类型，空肠中则主要为开放型细胞(图1：10B)。Ghrelin免疫阳性细胞被染为棕色到棕黑色，细胞界限不清晰，在有些细胞的中央或边缘位置可见半透亮的细胞核，表明ghrelin阳性染色物质位于细胞质中，且分布不均。这些研究结果与鸡[13]、兔[16]、山羊[9]、非洲鸵鸟[23]等保持一致。

综上所述，ghrelin在食蟹猴消化系统中的胃、十二指肠、空肠前段到中段、胰腺中均有表达，而在口腔黏膜、食管、空肠后段到直肠、肝脏中均无表达。与其他动物在体内分布部位的相似，提示ghrelin在进化上的保守性，物种之间具有差异性。

4 结论

免疫组化染色发现，ghrelin阳性细胞在食蟹猴的消化系统中有分布；ghrelin细胞在胃腺中主要分布于腺体的体部和底部，腺体的颈部和胃黏膜上皮中分布极少。肠道中的ghrelin细胞主要分布在小肠腺，少量分布于肠绒毛上皮中。根据细胞顶端是否到达腺体腔面，可将胃肠道中的ghrelin细胞分为“开放型”和“封闭型”，ghrelin免疫阳性细胞被染为棕色到棕黑色，细胞界限不清晰，在有些细胞的中央或边缘位置可见半透亮的细胞核，说明ghrelin阳性物质分布在细胞质中，且阳性产物在胞质中的分布不均一。