五味消毒饮HPLC 指纹图谱建立及10 种成分同时测定

沈 晗黄玉宇 沈夕坤陈 汀

（1.安徽中医药大学，安徽合肥 230012；2.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏苏州 215009）

五味消毒饮出自《医宗金鉴》，由金银花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、天葵子组成，具有清热解毒、消痈散结的作用［1］，方中各药药力专一，均能清热解毒，为治疗疖疔疮痈的经典方剂。文献［2-8］报道，这5 种中药（天葵子除外）均为有机酸、黄酮等抗炎、抗病毒成分，现代临床上常用于治疗外科急性感染，如急性乳腺炎、蜂窝组织炎等。

中药材质量会直接影响中药复方制剂质量，从而影响其临床疗效，但单一成分的定量测定无法全面反映中药材、中药复方质量。目前，中药指纹图谱正成为新兴的质量控制手段，它是一种综合的、可量化的鉴定手段［9］，能全面评价中药材、中药复方成分信息，对其筛选或控制具有一定的实用价值。因此，本实验建立五味消毒饮HPLC 指纹图谱，并同时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷的含量，以期为该制剂质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；AG285、AX26DR 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300VDB 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；KDC-140R 型超速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Direct-Q3UV 型超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 试剂与药物 绿原酸（批号110753-201415，纯度96.2%）、秦皮乙素（批号110741-201708，纯度99.9%）、咖啡酸（批号110885-201703，纯度99.7%）、木犀草苷（批号111720-201609）、蒙花苷（批号111528-201710，纯度96.6%）对照品均购自中国食品药品研究检定院；新绿原酸（批号4974，纯度≥98.0%）、隐绿原酸（批号3208，纯度≥98.0%）、异绿原酸B（批号3089，纯度≥98.0%）、3，5-二咖啡酰奎宁酸（批号3089，纯度≥98.0%）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（批号3001，纯度≥98.0%）对照品均购自上海诗丹德生物技术有限公司。金银花（批号190416，产地山东）、野菊花（批号190401，产地江苏）均购自苏州市博源药业有限公司；蒲公英（批号190721，产地江苏）、紫花地丁（批号190501，产地江苏）均购自苏州市天灵饮片公司；天葵子（批号190318，产地江苏）购自春晖堂药业有限公司，上述药材经南京中医药大学附属苏州市中医医院沈多荣副主任中药师鉴定为正品。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 五味消毒饮制备 按处方比例称取2 剂药材量，加18 倍量水浸泡30 min 后煎煮2 次，每次30 min，滤液合并浓缩至500 mL，即得。同法制备10 批样品（S1～S10），批号分别为20191011、20191012、20191013、20191014、20191015、20191016、20191017、20191018、20191019、20191020。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解稀释，即得（各成分质量浓度分别为0.494 0、0.175 0、0.365 2、0.032 9、0.260 6、0.011 3、0.364 6、0.006 8、0.005 2、0.002 7 mg／mL）。

2.2.2 对照药材溶液 按“2.1”项下工艺制备金银花、紫花地丁、野菊花、蒲公英、天葵子溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液 精密量取“2.1”项下制剂3 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，超声（45 kHz）处理30 min，14 000 r／min 离心5 min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 阴性样品溶液 按“2.1”项下处方比例和制备工艺，分别制备缺金银花、缺紫花地丁、缺野菊花、缺蒲公英、缺天葵子的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱，程序见表 1；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长320 nm，进样量5 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.4 HPLC 指纹图谱建立

2.4.1 精密度试验 取“2.1”项下样品（S1），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定6 次，以11 号峰（绿原酸）为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD 为0.032%～0.478%，相对峰面积RSD 为0.144%～2.607%，相似度均大于0.999，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取“2.1”项下样品（S1），按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，以11 号峰（绿原酸）为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD 为0.030%～0.488%，相对峰面积RSD 为0.168%～2.534%，相似度均大于0.997，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取“2.1”项下样品（S1），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3”项色谱条件下进样测定，以11 号峰（绿原酸）为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD 为0.040%～1.165%，相对峰面积RSD 为0.150%～2.260%，相似度均大于0.995，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 图谱生成 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液（S1～S10），在“2.3”项色谱条件下进样测定，将所得数据导入2012 年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，以S1 为参照，设定时间窗宽度为0.1 min，经多点校正后进行全谱峰匹配，结果见图1～2。由此可知，10 批样品中有34个共有峰，其相似度分别为 0.973、0.993、0.998、0.999、0.985、0.995、0.997、0.996、0.999、0.994，均大于0.97，说明样品之间质量差异较小。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for ten batches of samples

再选择分离度好、峰面积高的11 号峰（绿原酸）作为参照，计算共有峰相对保留时间和相对峰面积，见表2～3。由此可知，各批样品之间共有峰相对保留时间的差异较小（RSD＜0.37%），但有些批次之间差异较大（RSD＞10%），这是因为峰面积越小，误差越大，RSD 也会随之增加。

图2 各成分对照图谱Fig.2 Reference chromatogram of various constituents

2.4.5 共有峰归属及鉴定 根据各药材HPLC 色谱图（图3）及保留时间，可知共有峰来自金银花的有1、5、7、11、12、14～16、18、25、28～29、31 号峰，来自蒲公英的有1、8、11、14、16、24～25、27～29、34 号峰，来自野菊花的有5、11～12、14、17、19、25～26、28～33 号峰，来自紫花地丁的有6、13、19、23～27、29、32、34 号峰，来自天葵子的只有16 号峰。其中，5、11～14、25、28～29、31～32 号峰通过查阅文献［10-19］和比对标准品，分别鉴定为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸和蒙花苷，并且13 号峰（秦皮乙素）、32 号峰（蒙花苷）分别是紫花地丁、野菊花特征峰。另外，2～4、9～10、20～22 号峰尚无药材归属，可能它们在煎煮过程中产生了新成分。

图3 各药材HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various medicinal materials

表2 共有峰相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks

2.5 各成分含量测定

2.5.1 色谱条件 同“2.3”项。

2.5.2 线性关系考察 取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL 测定，以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表4，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5.3 精密度试验 取“2.1”项下样品（S1），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷峰面积RSD 分别为1.19%、0.39%、0.36%、0.40%、0.90%、1.02%、1.23%、1.24%、1.31%、1.39%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性实验 取“2.1”项下样品（S1），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷峰面积RSD 分别为2.22%、2.13%、2.06%、1.94%、2.25%、2.21%、2.57%、2.69%、3.10%、2.92%，表明该方法重复性良好。

表3 共有峰相对峰面积Fig.3 Relative peak areas of common peaks

表4 各成分线性关系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.5 稳定性试验 取“2.1”项下样品（S1），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷峰面积RSD 分别为2.08%、1.65%、1.58%、1.53%、1.73%、2.67%、2.68%、2.78%、3.07%、2.86%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取“2.1”项下样品（S1），按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，各精密吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，加入对照品溶液，甲醇定容至刻度，在“2.5.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷平均加样回收率分别为100.96%、100.37%、99.74%、97.12%、100.33%、97.05%、104.50%、97.43%、103.00%、95.16%，RSD 分别为1.09%、1.79%、1.45%、3.95%、1.94%、1.83%、4.79%、3.68%、2.91%、4.90%。

2.5.7 测定结果 取10 批样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表5。

表5 各成分含量测定结果（mg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论

3.1 煎煮条件确定 本实验在进行煎煮前，先对方剂煎煮因素进行了筛选，包括药材加水量、方剂浸泡时间、煎煮时间，发现在相同的浸泡时间、煎煮时间下随着加水量增加，指标性成分含量越来越高，在加水量为18 倍时曲线出现拐点，从节能高效的原则出发，选择18 倍量；《医疗机构中药煎药室管理规范》 规定，一般浸泡时间不得低于30 min，而且相关文献也表明中草药浸泡时间在20～30 min 即可，故选择30 min；考察了煎煮时间10、20、30、40、50 min，发现大部分成分的折线图在30 min 后出现拐点，而且随着时间延长其含量降低，故选择30 min。最终确定，煎煮条件为药材加18 倍量水浸泡30 min 后煎煮2 次，每次30 min。

3.2 流动相确定 本实验考察了0.05% 磷酸-乙腈、0.1% 磷酸-乙腈、0.05% 磷酸-甲醇、0.1% 磷酸-甲醇，发现0.1%磷酸-乙腈洗脱时各成分色谱峰峰形较好。

3.3 检测波长确定 本实验比较了230、260、290、320 nm 波长处各成分色谱信息，发现在320 nm处色谱峰分离度、峰形较好，故选择其作为检测波长。

3.4 指标成分确定 对于指标成分的选择，应从中药君臣佐使配伍理论、复方临床功效及成分有效性、可测性、特殊性的角度出发［20］。五味消毒饮中金银花是君药，故应首要考虑该药材；全方功效清热解毒、消痈散结，故还应针对其有效性进行选择；特殊性是指能代表某一类药或某一个药的化学成分［21］，如紫花地丁中秦皮乙素、野菊花中蒙花苷；可测性是指可进行定性鉴别、定量分析的指标成分［22］。金银花、野菊花、蒲公英均含有酚酸、黄酮类成分，其中金银花总酚、总环烯醚萜均具有明显的抗炎作用，以前者最强［15］；以咖啡酰基奎宁酸结构单元为主的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸也具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒等作用［22］；木犀草苷在上述3 种药材中均存在，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等作用［23］；蒲公英中的酚类成分在抗炎方面也发挥着重要作用［14］；蒙花苷［6］是野菊花中特有的黄酮类成分，秦皮乙素［8］是紫花地丁主要活性成分，均有抗炎作用。因此，本实验选择上述10 种成分作为指标。

4 结论

本实验建立五味消毒饮HPLC 指纹图谱，并同时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁、4，5-二咖啡酰奎宁、蒙花苷的含量，该方法准确可靠，重复性好，可用于该制剂的质量控制。另外，五味消毒饮中黄酮、酚酸、萜类成分等有效物质很多，今后将进一步结合紫外、红外、质谱对其进行分析。