峰面积比值法分析混合DNA扩增产物的比例关系

牛青山温文娇潘永锋王金换辛 阳

（1 中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035；2 沈阳市公安局刑事科学技术研究所 辽宁 沈阳 110000）

峰面积比值法分析混合DNA扩增产物的比例关系

牛青山1温文娇1潘永锋2王金换1辛 阳1

（1 中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035；2 沈阳市公安局刑事科学技术研究所 辽宁 沈阳 110000）

探究混合DNA样本扩增前后二者混合比例变化情况。将DNA检验标准品按不同比例混合，经扩增电泳激光扫面检测分析，通过比较峰面积推算混合样本扩增后的比例，并与扩增前的混合DNA样本比例进行比较。混合DNA经扩增后其混合比例基本保持不变。

混合DNA PCR-STR 峰面积比例

在法医学DNA检验分析中，对混合样本的DNA检验分析已成为热点。目前对混合DNA检材的检验鉴定的难点是如何确定扩增产物的基因座分型。由于没有一种科学有效的方法，使混合DNA样本的分型遇到很多困难。本文应用已知标准DNA样品对混合DNA扩增产物与混合DNA的比例关系进行研究。通过研究确认，混合DNA的扩增产物的峰面积与混合DNA存在正比例关系，为混合DNA检材的基因座分型提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本

DNA检验标准品9947A（女性） 与9948（男性）。

1.2 主要试剂与仪器

PowerPlex21 System（美国），9700型扩增仪（ABI公司，美国），3130XL型序列分析仪（ABI公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 分组

将初始浓度为10ng/μL的9947A和9948分别稀释至浓度为0.5ng/μL，按照9947A∶9948为1∶1、1∶3、1∶4、1∶9、1∶19的比例配置浓度梯度样本组。

1.3.2 PCR扩增及检测

用9700型扩增仪扩增，体系10μL，其中分别取1μL和2μL DNA模板量进行扩增，扩增时选用28和29个循环分别进行扩增。检测用3130XL序列分析仪电泳，结果用GenemapperID-X软件进行分析。

2 结果

9947A和9948混合样品扩增产物在D3S1358、D1S1656、PentaE、D18S51、CSF1P0、TH01、D12S391、D19S433、FGA9个位点呈现出3峰状态。我们将同一位点的峰根据峰面积大小依次定义为1、2、3号峰，其中1号峰称之为大峰，2、3号峰称之为小峰。通过已知基因型，我们已知PentaE与D1S1656均为纯合子与杂合子的混合，其余7个位点为杂合子与杂合子的混合，因此，将这两种混合类型分别进行观察讨论。我们通过观察计算比较9个位点的等位基因峰面积情况，得出下列结果。

2.1 不同体积DNA模板混合时，2、3号峰面积与1号峰面积比

混合DNA模板量为1μL时，扩增后各基因座上2、3号峰面积和与1号峰面积的比值，如表1所示。DNA混合样本比例为1∶1～1∶19时，其2、3号峰面积和与1号峰面积的比值分布在1.02～1.63之间，平均值分布于 1.12～1.26之间，方差分布于0.007～0.047之间。

表1 DNA模板量为1μL时各基因座上2、3号峰面积和与1号峰面积之比

混合DNA模板量为2μL时，扩增后各基因座上2、3号峰面积和与1号峰面积的比值，如表2所示。DNA混合样本比例为1∶1～1∶19时，其2.3号峰和与1号峰的比值分布在1.00～1.31之间，平均值分布于1.08～1.13之间，方差分布于0.001～0.017之间。

表2 DNA模板量为2μL时各基因座上2、3号峰面积和与1号峰面积之比

2.2 不同体积DNA模板混合时，2、3号峰面积比

混合DNA模板量为1μL时，扩增后各基因座上2、3号峰面积的比值，如表3所示。DNA混合样本比例为1∶1～1∶19时，其2、3号峰比值分布在1.05～18.27之间，平均值分布于1.20～13.50之间，方差分布于0.03～11.857之间。

表3 DNA模板量为1μL时各基因座上2、3号峰面积之比

混合DNA模板量为2μL时，扩增后各基因座上2、3号峰面积的比值，如表4所示。DNA混合样本比例为1∶1～1∶19时，其俩小峰比值分布在1.03～19.39之间，平均值分布于1.21～14.05之间，方差分布于0.018～27.177之间。

表4 DNA模板量为2μL时各基因座上2、3号峰面积之比

2.3 混合DNA扩增产物经电泳和GenemapperIDX分析后，PentaE与D1S1656位点上2、3号峰面积与1号峰面积比较

混合DNA模板量为1μL时，扩增后各基因座上2、3号峰面积与1号峰面积的比值，如表5所示。DNA混合样本比例为 1∶1～1∶19时，PentaE与D1S1656位点上2、3号峰和与1号峰的比值分别分布在1.15～10.82、1.04～1.44之间，2、3号峰之比分别在1.14～4.96、1.23～30.50之间变化。

混合DNA模板量为2μL时，DNA混合样本比例为1∶1～1∶19时，PentaE与D1S1656位点上2、3号峰和与 1号峰的比值分别分布在 1.11～14.82、1.05～1.24之间，2、3号峰之比分别在1.08～3.90、1.22～11.56之间变化。

表5 PentaE与D1S1656位点2、3号峰面积与1号峰面积比较

2.4 混合DNA扩增产物经电泳和GenemapperIDX分析后，X、Y位点上峰面积

混合DNA样本扩增后X、Y位点上峰面积的比值，如表6所示。混合DNA样本比例为11时，X、Y的峰面积比值分布于2.76～4.59之间；混合DNA样本比例为1∶3时，X、Y的峰面积比值分布于1.46～3.12之间；混合DNA样本比例为1∶4时，X、Y的峰面积比值分布于1.13～1.67之间；混合DNA样本比例为1∶9时，X、Y的峰面积比值分布于1.00～1.41之间；混合DNA样本比例为1∶19时，X、Y的峰面积比值分布于0.92～1.38之间。

表6 扩增后X、Y的峰面积之比

3 讨论

本次试验在排除stutter带影响的前提下，研究了混合DNA扩增产物及基因座的电泳峰与混合比例的关系。

通过统计学分析，在某一位点为纯合子与杂合子的混合，且没有共同位点时，三个峰的峰面积的比值随混合DNA样本比例的改变而改变，并与初始混合比例近似相等。在系统统计其他位点比例关系的条件下，可以确定混合样品的基因分型。例如，结合其他位点发现，1号峰为纯合子来自一个个体，2、3号峰为杂合子来源于另一个体。

当某一位点为杂合子与杂合子的混合，且有共同位点时，2、3号峰面积之和与1号峰面积的比值不随DNA混合样本比例的改变而改变，近似等于1，那么可以推断该位点为杂合子与杂合子的混合，且1号峰为两者共有，2、3号峰分别来自于两个不同的个体。此时2、3号峰的比值随DNA混合样本比例的改变而改变，并与初始混合比例近似相等。

在混合DNA样本比例1∶1时，2、3号峰的比率在1.20～1.26之间变化；在混合DNA样本比例为1∶3时，2、3号峰的比率在1.26～4.10之间变化；在混合DNA样本比例1∶4时，2、3号峰的比率在3.47～5.62之间变化；在混合DNA样本比例为1∶9时，2、3号峰的比率在7.37～8.95之间变化；在混合DNA样本比例 1∶19时，2、3号峰的比率在13.48～19.22之间变化。根据以上数据可以看出，在混合 DNA样本比例在 1∶1～1∶19时，扩增后D3S1358等7个位点上，2、3号峰的比率均接近于初始比例。因此当混合DNA为杂合子与杂合子的混合形式时，我们可以用两个小峰的峰面积来估算扩增后混合DNA的比例。

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（责任编辑：于 萍）

DF795.2

A

2014-09-15

牛青山（1964-），男，山东济南人，中国刑警学院法医学系教授，硕士，主要从事法医物证学研究。