大孔吸附树脂富集纯化玳玳花总黄酮

侯梦阳 胡文忠∗修志龙郝可欣于皎雪王澳盛张梦琦

（1.大连理工大学生物工程学院，辽宁大连 116024；2.大连民族大学生命科学学院，生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁大连 116600）

玳玳花为芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥花蕾，主要分布在热带及亚热带地区，其味苦，性平，功效强心、利尿、清血、化痰、疏肝和胃、理气解郁等［1］，含有黄酮、强心苷、生物碱、挥发油、多糖类等化合物［2-3］，以黄酮为主，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、预防动脉粥样硬化等活性［4-6］。Yang 等［7］对玳玳花总黄酮超声提取工艺进行了研究；苏浬［8］采用大孔树脂层析法，在水提醇沉工艺的基础上对该成分进行了纯化。但Karimi 等［9］报道，水提法提取玳玳花总黄酮时提取率较低，而且在大孔吸附树脂柱层析前要经过一步醇沉工艺，会导致其回收率降低。

大孔吸附树脂具有理化性质稳定、纯化工艺操作简单、便于工业化生产等优点，被广泛应用于药材中总黄酮的分离纯化，如紫菀［10］、铁皮石斛［11］、淫羊藿［12］等，均取得了较好的效果。因此，本实验将比较NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301 大孔吸附树脂对玳玳花总黄酮的吸附、解吸性能，应用吸附动力学、热力学模型对吸附过程进行研究，再优化该成分富集纯化工艺，旨在为其工业化开发利用提供理论依据。

1 材料

UV-2550 紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；SHA-CA 往复式水浴振荡器（金坛市顺华仪器有限公司）。NKA-9、X-5、DM301、AB-8、D101、HPD100、HPD400、HPD600 大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。玳玳花采自云南省昆明市，经黑龙江中医药大学陈效忠副教授鉴定为柑橘属植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥花蕾。芦丁对照品（上海源叶生物科技有限公司）；氢氧化钠、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 线性关系考察 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法［13］。吸取对照品溶液（称取芦丁对照品20 mg，40%乙醇定容至25 mL 量瓶中，质量浓度为0.8 mg／mL）150、300、450、600、750、900 μL，置于10 mL 量瓶中，加入5%NaNO2溶液300 μL，摇匀后静置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液300 μL，摇匀后静置6 min，加入4%NaOH 溶液2 mL，30% 乙醇定容至刻度，摇匀，静置10 min，在510 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），芦丁质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为A＝10.957 4X-0.001 9（R2＝0.999 6），在12～72 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.2 提取液制备 将100 g 干燥药材粉末（过30 目筛）用70%乙醇浸泡过夜后，在60 ℃下加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液后过滤，减压浓缩至无醇味，蒸馏水定容至1 000 mL，即得（质量浓度为5.88 mg／mL），再用蒸馏水将其质量浓度分别稀释至原有的5／6、4／6、3／6、2／6、1／6，即4.90、3.92、2.94、1.96、0.98 mg／mL。

2.1.3 精密度试验 吸取“2.1.1”项下对照品溶液600 μL，按“2.1.1”项下方法在1 d 内测定6 次吸光度，测得其RSD 为0.51%，表明该方法日内精密度良好；同法连续测定吸光度3 d，每天1 次，测得其RSD 为0.87%，表明该方法日间精密度良好。

2.1.4 重复性试验 吸取“2.1.2”项下5.88 mg／mL提取液600 μL，按“2.1.1”项下法测定6 次吸光度，测得其RSD 为0.74%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验 吸取“2.1.2”项下5.88 mg／mL提取液600 μL，于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.1”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.13%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.6 加样回收率试验 称取芦丁含量已知的“2.1.2”项下5.88 mg／mL 提取液6 份，每份600 μL，精密加入“2.1.1”项下对照品溶液400 μL，按“2.1.1”项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，芦丁平均加样回收率为98.12%，RSD 为0.84%。

2.2 静态吸附、解吸实验

2.2.1 树脂筛选 称取预处理好的树脂1 g（干重），置于250 mL 具塞锥形瓶中，加入“2.1.2”项下5.88 mg／mL 提取液50 mL 后置于摇床中，在25 ℃下振荡24 h（150 r／min）。达到吸附平衡后，用去离子水清洗树脂，加入50 mL 95%乙醇解吸后置于摇床中，在25 ℃下振荡24 h（150 r／min），测定溶液中总黄酮质量浓度，即为吸附平衡浓度。

2.2.2 吸附动力学研究 称取预处理好的AB-8 树脂1 g（干重），置于150 mL 具塞锥形瓶中，加入“2.1.2”项下5.88 mg／mL 提取液50 mL 后置于摇床中，在25 ℃下振荡12 h（150 r／min），在吸附时间0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240 min 各取600 μL 吸附后的样品溶液，测定t时刻总黄酮质量浓度Ct（mg／mL），计算吸附能力Qt（mg／g）、平衡吸附能力Qe（mg／g），公式分别为Qt ＝Vi（C0-Ct）、Qe＝Vi（C0-Ce）。其中，C0为总黄酮初始质量浓度，单位mg／mL；Ce为吸附平衡质量浓度，单位mg／mL；Vi为样品体积，单位mL。

采用准一级动力学、准二级动力学、粒子扩散模型描述总黄酮吸附过程，分别为ln（Qe-Qt）＝-k1t +lnQe、其中，k1为准一级动力学速率常数，单位min-1；k2为准二级动力学速率常数，单位g／（g·min）；kd、Cd为粒子扩散速率常数，单位mg／（g·min1／2）、mg／g。

2.2.3 吸附热力学研究 称取预处理好的AB-8 树脂1 g（干重），置于250 mL 具塞锥形瓶中，加入“2.1.2”项下6 个质量浓度提取液各50 mL，在298.15、308.15、318.15 K 下振荡（150 r／min），测定总黄酮平衡浓度Ce、Qe，绘制吸附等温线，计算吸附热力学参数。

采用Langmuir、Freundlich、Temkin 吸附等温线模型描述吸附过程，分别为、Qe＝BTlnCe+BTlnKT。其中，Qe为平衡吸附能力，单位mg／g；Qm为理论最大吸附能力，单位mg／g；Ce为平衡质量浓度，单位mg／L；KL为Langmuir 常数，单位L／mg；KF为Freundlich 常数，单位［（mg／g）（L／mg）1／n］；BT、KT为Temkin 常数，单位J／mol、L／mg；1／n为Freundlich 经验常数。

吸附热力学函数包括吉布斯自由能变化（ΔG）、焓变（ΔH）、熵变（ΔS），分别为ΔG ＝-RTlnKeq、lnKeq＝-其中，R为理想气体常数［8.314 J／（mol·K）］；T为绝对温度，单位K；Keq为热力学平衡常数，单位L／g。

2.3 动态吸附、解吸实验 将预处理好的AB-8树脂采用湿法装入层析柱（16 mm×300 mm，1 BV＝20 mL），总黄酮粗提液以不同体积流量（2、3、4、5 BV／h）上柱，5 BV 蒸馏水缓慢洗脱以除去杂质，再取30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各10 BV，以2 BV／h 体积流量进行洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮质量浓度，考察乙醇体积分数对解吸率的影响。取最佳体积分数洗脱液，以不同体积流量（2、3、4、5 BV／h）洗脱，测定流出液中总黄酮质量浓度，考察上样体积流量、上样量，以及洗脱剂质量浓度、洗脱体积流量、用量等工艺参数对吸附、解吸性能的影响。

3 结果

3.1 树脂筛选 图1 显示，AB-8、NKA-9、DM301、D101 树脂对总黄酮的吸附能力较高，均高于80 mg／g；AB-8、DM301、D101 树脂对总黄酮的解吸能力较高，均高于50 mg／g；AB-8 树脂解吸率最高，HPD400 树脂解吸率最小。最终，选择AB-8 树脂富集纯化总黄酮。

图1 总黄酮吸附能力、解吸能力、解吸率Fig.1 Adsorption capacities，desorption capacities and desorption rates of total flavonoids

3.2 静态吸附动力学 吸附动力学是研究在特定初始浓度、温度、压力下吸附剂对吸附质的吸附速率，有助于实际操作中工艺参数的优化及加工设备的选择［14］。图2 显示，AB-8 树脂对总黄酮的吸附能力随着时间延长而增加，在前60 min 更明显，之后趋于缓慢，在120 min 时达到平衡。

动力学方程及相关参数见表1，可知准二级吸附动力学模型方程计算得到的理论平衡吸附量（103.092 8 mg／g）更接近实验值（95.894 1 mg／g），能较好地描述总黄酮静态吸附过程。

图2 总黄酮静态吸附动力学曲线Fig.2 Kinetic curve for static adsorption of total flavonoids

表1 总黄酮动力学方程及相关参数Tab.1 Kinetic equations and related parameters for total flavonoids

3.3 静态吸附热力学

3.3.1 吸附等温线 对吸附等温曲线的研究有助于探讨吸附质和吸附剂之间的相互作用，从而优化操作参数，节约能源［15］。图3 显示，AB-8 树脂对总黄酮的平衡吸附能力随着其质量浓度升高而增加，在低质量浓度下更明显，为4.90 mg／mL 时达到最大，故以其为上样液质量浓度；Qe随着温度升高而下降，表明吸附为放热过程。

等温线方程及相关参数见表2，可知随着温度升高，KL、KF均减小，表明降低温度有利于总黄酮吸附；0＜1／n＜1，表明该吸附过程容易进行［16］；与Freundlich、Temkin 模型比较，Langmuir 模型具有较高的R2，可较好地描述吸附过程。

图3 总黄酮静态吸附等温线Fig.3 Isotherms for static adsorption of total flavonoids

3.3.2 吸附热力学函数 以1／T为横坐标（X），lnKeq为纵坐标（Y）进行拟合，得方程为Y ＝306.694 0X +1.514 2（R2＝0.991 8），再根据其斜率、截距分别计算ΔH、ΔS，结果见表3。由此可知，ΔG、ΔH均为负值，表明吸附为自发放热过程［17］；ΔH绝对值小于40 kJ／mol，表明吸附为物理过程［18］；ΔS为正值，表明吸附为熵增过程，即AB-8 树脂吸附总黄酮后，整个吸附系统的无序度增大。

表2 总黄酮等温线方程及相关参数Tab.2 Isotherm equations and related parameters for total flavonoids

表3 总黄酮吸附热力学参数Tab.3 Thermodynamic parameters for total flavonoids

3.4 动态吸附、解吸实验

3.4.1 泄露曲线分析 一般而言，流出液中目标物浓度达到上样液浓度的10%时，即可认为达到泄露点［19］。取“2.1.2”项下4.90 mg／mL 提取液，以不同体积流量（2、3、4、5 BV／h）通过树脂柱，动态泄露曲线见图4，可知在低体积流量下AB-8 树脂对总黄酮具有较强的吸附能力，即有利于该成分充分吸附，故本实验选择2 BV／h 作为上样体积流量，达到泄漏点时的上样量为7 BV。

图4 总黄酮动态泄露曲线Fig.4 Dynamic leakage curves for total flavonoids

3.4.2 乙醇体积分数对洗脱效果的影响 先用5 BV蒸馏水缓慢洗脱以除去杂质，再取30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 乙醇各10 BV，以2 BV／h 体积流量进行洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮质量浓度，结果见图5。由此可知，随着乙醇浓度体积分数增加，解吸率不断升高，为70%时达到最大值86.26%，但之后反而开始下降，故选择70%作为乙醇体积分数。

3.4.3 解吸曲线分析 先用5 BV 蒸馏水洗脱除去水溶性杂质，再用70% 乙醇以不同体积流量（2、3、4、5 BV／h）进行洗脱，每过一定时间收集洗脱液，计算解吸率，结果见图6。由此可知，随着体积流量增加，解吸效果降低，这是因为体积流量较高时会导致洗脱剂与AB-8 树脂的接触时间变短，不能充分洗脱被吸附的总黄酮，而且2、3 BV／h的解吸效果无明显差异，为了提高操作效率，本实验选择3 BV／h 作为解吸体积流量，此时解吸液用量为6 BV。

图5 乙醇体积分数对总黄酮解吸率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption rate of total flavonoids

图6 总黄酮动态解吸曲线Fig.6 Dynamic desorption curves for total flavonoids

3.5 验证试验 取“2.1.2”项下4.90 mg／mL 提取液7 BV，以2 BV／h 体积流量缓慢加到AB-8 树脂柱中，待吸附完全后用5 BV 蒸馏水洗脱除去水溶性杂质，再取6 BV 70%乙醇，以3 BV／h 体积流量进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，测得总黄酮纯度由9.87%升高至36.75%，回收率为83.17%，表明该纯化工艺稳定可行。

4 讨论

大孔吸附树脂是将吸附性、筛选性相结合的分离材料，其吸附能力由孔径、比表面积、表面极性等因素所决定，作用力主要包括范德华力和氢键［20］。本实验发现，AB-8 大孔吸附树脂对玳玳花总黄酮吸附、解吸性能最强，与苏浬［8］报道一致，它具有相对较大的比表面积，有利于该成分吸附，并且相对较大的孔径也有利于其解吸。

AB-8 大孔吸附树脂对玳玳花总黄酮的吸附过程最符合二级动力学模型，整个吸附过程被分为2 个阶段，拟合曲线均未通过原点，表明颗粒内扩散不是唯一控制吸附过程的步骤，在一定程度上也受到边界层扩散的影响［21］，同时也符合Langmuir等温线模型，属于单分子层吸附。经过1 次层析后，玳玳花总黄酮纯度从9.87% 提高至36.75%，回收率为83.17%，表明AB-8 大孔吸附树脂可有效富集纯化该成分，有望应用于其工业化制备中。