UPLC-MS／MS 法同时测定双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中7 种成分

2021-03-07杨浩天宋浩静董占军

中成药 2021年1期

杨浩天，邱博，宋浩静，董占军

（河北省人民医院药学部，河北石家庄 050051）

双丹方由丹参、牡丹皮配伍而成，方中丹参味苦，性微寒，归心、肝经，有通经止痛之功效；牡丹皮性味归经与丹参相近，可使血凉而不淤，血活而不妄行，两药合用时可增强活血化瘀功效，临床上常用于治疗心脉淤阻所致的冠心病、心绞痛等症［1］。它因其疗效确切而被开发成多种剂型，包括胶囊、颗粒、口服液［2-3］，三者功能主治虽相同，但制剂中两药配比、生产工艺等均有所差异。中药药效不仅取决于特征成分含量，更受其他活性成分影响，故双丹方相关制剂的药效物质基础及作用机理仍值得探讨。

丹参活性成分大多为二萜类、酚类衍生物，而牡丹皮中丹皮酚含量较高［4-9］，对两者药效评价的研究较多，但配伍过程中其所含成分的结构及含量均发生变化，而且目前相关检测方法大多为HPLC法［9］，并不适用于无紫外吸收或痕量物质的分析。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）法灵敏度高，专属性强，简便高效，被广泛地应用于中药复方活性成分的测定［10-11］，故本实验采用该方法同时测定双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸的含量，以期为相关制剂的质量控制及临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-30A 型超高效液相色谱系统（日本Shimadzu 公司）；Triple Quad 5500 型三重四极杆MS 仪，配置Analyst 1.6 数据采集系统（美国AB Sciex 公司）；BP211D 型电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；S150 实验室应用型超声波清洗器（德国Elma 公司）；Sorvall ST16R 型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；MIULAB MIX-25P 型涡旋仪（杭州米欧仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物丹参酮ⅡA（纯度99.5%，批号110766-201721）、丹皮酚（纯度99.9%，批号110708-201407）、没食子酸（纯度90.8%，批号110831-201605）、原儿茶酸（纯度99.9%，批号110809-201205）对照品均购自中国食品药品检定研究院；丹参素（纯度98.0%，批号180628）对照品购自北京普天同创生物科技有限公司；丹酚酸B（纯度98.0%，批号18071704）、迷迭香酸（纯度98.0%，批号17081316）对照品均购自上海士锋生物科技有限公司。双丹胶囊（广州莱泰制药有限公司，批号181007、181104、190414）；双丹颗粒（山东孔圣堂制药有限公司，批号1901004、1901007、1901105）；双丹口服液（北京九龙制药有限公司，批号190101、190116、190312）。乙腈、甲酸均色谱纯（德国默克公司）；水为超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 XBridge BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱（0～2.0 min，5%～30% A；2.0～3.5 min，30%～75% A；3.5～5.5 min，75%～90% A；5.5～6.0 min，90%～5%A；6.0～6.5 min，5%A）；体积流量0.5 mL／min；柱温35 ℃；进样量5 μL。

2.2 质谱条件电喷雾电离源（ESI），多反应监测模式（MRM），正负离子同时扫描；温度550 ℃；喷射电压5 500 V（ESI+）、-4 500 V（ESI-）；雾化气（Gas 1）、加热气（Gas 2）压力55 psi（1 psi＝0.133 kPa）；气帘气压力35 psi。各成分参数见表1。

表1 各成分MS 参数Tab.1 MS parameters for various constituents

2.3 对照品溶液制备精密称取丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸对照品适量，置于10 mL 量瓶中，乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取适量，50%乙腈稀释，即得（各成分质量浓度分别为1 140.0、2 675.0、2 725.0、1 680.0、488.0、156.0、137.5 ng／mL）。

2.4 供试品溶液制备取双丹胶囊内容物、双丹颗粒适量，置于研钵中充分研磨均匀，分别取约500 mg，精密称定，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 50%乙腈，称定质量，超声提取60 min，放冷，50%乙腈补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，50% 乙腈稀释100 倍，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，即得；精密量取双丹口服液1 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，稀释1 000 倍，即得。

2.5 专属性试验在本实验所用色谱和质谱条件下，各成分峰形良好，且无杂峰干扰，表明方法专属性强。各成分对照品、供试品色谱图见图1。

图1 各成分LC-MS／MS 色谱图Fig.1 LC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察精密量取“2.3”项下对照品溶液适量，50% 乙腈稀释成系列质量浓度，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，并分别以S／N ＝10、S／N ＝3 时为定量限、检测限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验取“2.3”项下中间质量浓度的对照品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定6 次，测得丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸峰面积RSD 分别为2.1%、1.8%、0.7%、2.4%、1.2%、1.5%、2.6%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验取供试品溶液（双丹胶囊批号181007，双丹颗粒批号1901004，双丹口服液批号190101），于室温下放置1、2、4、8、16 h 后，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，测得双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸峰面积RSD 分别为1.4%、2.2%、1.7%、3.5%、2.4%、3.7%、2.8%；2.6%、1.9%、3.1%、3.3%、2.8%、1.1%、3.6%；2.3%、4.2%、1.9%、3.0%、1.4%、2.7%、2.5%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验取同一批双丹胶囊（批号181007）、双丹颗粒（批号1901004）、双丹口服液（190101），按“2.4”项下方法各平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，测得双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸含量RSD 分别为1.4%、2.2%、1.7%、3.5%、2.4%、3.7%、2.8%；2.6%、1.9%、3.1%、3.3%、2.8%、1.1%、3.6%；2.3%、4.2%、1.9%、3.0%、1.4%、2.7%、2.5%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验精密称取各成分含量已知的双丹胶囊（批号181007）、双丹颗粒（批号1901004）各250 mg，精密量取双丹口服液500 μL，各加入对照品溶液500 μL，平行6 份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，双丹胶囊中丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸平均加样回收率分别为97.9%、101.4%、98.3%、97.1%、102.6%、100.5%、98.2%，RSD 分别为3.6%、2.6%、3.0%、1.8%、2.5%、1.4%、3.1%；双丹颗粒中各成分平均加样回收率分别为102.3%、98.1%、101.8%、97.6%、98.3%、102.1%、96.7%，RSD 分别为 2.1%、2.4%、1.1%、3.3%、1.9%、2.5%、3.8%；双丹口服液中各成分平均加样回收率分别为99.2%、97.0%、102.5%、100.7%、98.1%、101.9%、99.4%，RSD 分别为3.6%、2.4%、3.7%、1.5%、4.5%、1.8%、2.0%。

2.11 样品含量测定取不同批号双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液各3 批，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

由此可知，3 种制剂、同一制剂不同批次中各成分含量均存在差异，由于制剂在生产过程中的工艺参数相对固定，故造成上述现象的原因主要为原材料（药材或饮片）质量良莠不齐。中药品种庞杂，产地广泛，同名异物、同物异名现象普遍存在，当前药材、饮片、成方标准的制定思路是控制其中1 种或几种有效或特征成分的含量，而“中药质量标志物（Q-Marker）”这一概念的提出则完善健全了相关质量标准体系［12］。

表3 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n＝3）

2.12 日均摄入量测定由于患者服药后各成分摄入量更能真实地反映中成药量效关系，故本实验结合药品说明书及临床用法用量折算各成分日均摄入量，结果见表4。由此可知，3 种制剂中各成分日均摄入量差异较大，由高及低依次为双丹口服液、双丹颗粒、双丹胶囊；主要有效成分丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B、丹皮酚总摄入量占比均高于80%，其中丹参酮ⅡA、丹酚酸B 在双丹颗粒中最高，丹参素、丹皮酚在双丹口服液中最高，上述现象可归因为各类制剂生产工艺不同。2015 年版《中国药典》中双丹口服液的制备工艺采用水提醇沉法，可较大程度地将有效成分溶出，并且能去除部分杂质，但对双丹颗粒、双丹胶囊剂的制备方法鲜有报道［13-14］。中药配伍发挥疗效具有多成分、多靶点协同作用的特点，是一个复杂的体内过程，故药物作用强度除了与制剂中主要有效成分含量密切相关外，其作用方式、生物利用度、不同剂型对其体内吸收的影响等因素也会影响疗效［15］。

表4 各成分日均摄入量测定结果（mg／d， n＝3）Tab.4 Results of daily average intake determination of various constituents（mg／d， n＝3）

3 讨论

3.1 固体制剂提取条件筛选本实验考察了25%、50%、75% 甲醇及25%、50%、75% 乙腈，发现乙腈提取率略高于甲醇；以50% 或75% 乙腈超声60 min 时，双丹胶囊、双丹颗粒中各成分提取率均高于25%乙腈超声提取时，并且50%、75%乙腈超声提取时差异较小。再考察了超声时间30、60、90 min，发现提取60 min 或90 min 时各成分提取率均高于提取30 min 时，而提取60、90 min时无显著差异。因此，为控制试剂成本，提高实验效率，确定双丹胶囊、双丹颗粒最优提取条件为50%乙腈超声60 min。

3.2 色谱条件筛选本实验考察了不同型号、粒径的色谱柱，发现 XBridge BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）可实现各成分较好的分离。再考察了乙腈-水、乙腈-水（含0.1% 甲酸）、甲醇-水、甲醇-水（含0.1%甲酸），发现以乙腈-水（含0.1% 甲酸）梯度洗脱时可获得良好的峰形及较快的分析速度，故以其流动相。

3.3 质谱条件筛选由于各成分在结构、极性等方面存在差异，故本实验采用正负离子模式对其响应值进行考察。结果显示，丹参酮ⅡA 在正离子扫描模式下响应更强，而丹参素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、没食子酸、原儿茶酸在负离子扫描模式下具有更高的响应值。为了兼顾各成分测定以使其具有较高的灵敏度，本实验采用MRM 正负离子同时监测模式进行质谱分析。