HPLC-DAD 法同时测定益肾健骨丸中5 种成分

王雪梅，刘校栓，王宝才，李喜香，李盛华，戴 刚

（甘肃省中医院，甘肃兰州 730000）

益肾健骨丸是甘肃省中医院的院内制剂，由当归、枸杞子、苏木、丹参、白芍、生地黄、秦艽、女贞子、土鳖虫等18 味中药组成，方中酒茱萸、锁阳温补肾阳；枸杞子、女贞子、生地黄滋补肾阴，填精益髓；龙骨、牡蛎平肝潜阳，收敛固涩而益肾；苏木、丹参、土鳖虫活血化瘀，通络止痛；秦艽祛风通络；当归、杭白芍平肝健脾养血，诸药合用，共奏补益肝肾、固本强筋、壮骨蠲痹功效，用于治疗肾虚型膝骨性关节炎，疗效显著［1］。

复方制剂药效是组方药物多成分共同作用的结果，仅靠单一指标含量难以客观评价其质量，而多指标测定更为适合［2］。前期有报道采用HPLC 法对芩龙降压胶囊中龙胆苦苷、芍药苷、毛蕊花糖苷，以及益经颗粒中阿魏酸、芍药苷、毛蕊花糖苷进行定量分析［3-4］，故本实验采用HPLC-DAD 法同时测定益肾健骨丸中龙胆苦苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含量，以期为该制剂质量标准的提高和完善提供理论依据和实验基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies 公司）；360EP 型、125SM 型电子天平（德国Satorius 公司）；LA753 型实验室纯化水机（上海威立雅水务设备安装工程有限公司）；SB-320DTDN 型超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 龙胆苦苷（批号110770-201716，纯度97.1%）、马钱苷（批号111640-201706，纯度99.2%）、芍药苷（110736-201337，纯度95.7%）、阿魏酸（批号110773-20614，纯度99.0%）、毛蕊花糖苷（111530-201310，纯度92.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。益肾健骨丸（40 g／瓶，批号191201、191202、191203），由甘肃省中医院制剂中心制备。甲醇为色谱纯（天津市大茂化学试剂厂）；磷酸、甲醇等试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水（LA753 型实验室纯化水机制备）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取龙胆苦苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷对照品适量，甲醇制成每1 mL 分别含五者1.272、1.180、1.605、0.413、1.155 mg 的贮备液，精密吸取适量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（每1 mL 分别含五者381.60、35.40、240.75、12.375、34.65 μg）。

2.1.2 供试品溶液 取丸剂适量，研细，精密称取5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，称定质量，密塞，超声（220 W、40 kHz）处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按照处方工艺，制得缺秦艽、山茱萸、白芍、当归、生地黄的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～20 min，14% A；20～30 min，14%～20%A；30～44 min，20%～22%A；44～54 min，22%～32%A；54～66 min，32%～40%A；66～70 min，40%～42% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长230 nm（0～55 min，龙胆苦苷、马钱苷、芍药苷）、330 nm（55～70 min，阿魏酸、毛蕊花糖苷）；进样量10 μL。

2.3 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分均能达到基线分离（分离度＞1.5），阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下贮备液适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成分别含龙胆苦苷 63.6、127.20、254.40、381.60、508.80、636.00 μg／mL，马钱苷5.90、11.80、23.60、35.40、47.20、59.00 μg／mL，芍药苷40.125、80.25、160.50、240.75、321.00、401.25 μg／mL，阿魏酸 2.062 5、4.125、8.250、12.375、16.500、20.625 μg／mL，毛蕊花糖苷5.775、11.55、23.10、34.65、46.20、57.75 μg／mL的对照品溶液，分别精密吸取10 μL，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取“2.4”项下高、中、低质量浓度对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下各进样测定6 次，测得高质量浓度下龙胆苦苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积RSD分别为0.45%、0.86%、0.72%、0.94%、1.07%，中质量浓度下分别为0.98%、1.23%、1.09%、1.28%、1.36%，低质量浓度下分别为1.67%、1.88%、1.54%、1.92%、2.03%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取丸剂（批号191201）适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得龙胆苦苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为0.65%、1.48%、0.87%、1.76%、0.94%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批丸剂（批号191201）6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得龙胆苦苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为 1.28%、2.23%、2.52%、1.07%、2.06%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的丸剂（批号191201）适量，研细，精密称取粉末2.5 g，共6 份，置于具塞锥形瓶中，按100%水平精密加入“2.1.1”项下对照品溶液适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.9 样品含量测定 取3 批丸剂适量，每批3 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含量测定结果（μg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g， n＝3）

3 讨论

秦艽中含有大量龙胆苦苷，具有保肝、益肝、抗炎镇痛等多种药理作用［5］；酒茱萸中马钱苷在抗血栓、抗炎、抗氧化应激损伤等方面都有显著活性［6］；芍药苷作为白芍主要有效成分，具有补血、抗抑郁、镇痛、解痉等功效［7］；当归成分阿魏酸具有抗血小板聚集、增强前列腺素活性、镇痛缓解血管痉挛等活性［8］；毛蕊花糖苷是熟地黄特有药效成分，具有很强的抗炎、抗氧化作用，并可调节骨代谢［9-10］。因此，本实验选择龙胆苦苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷作为含量测定指标成分。

5 种成分紫外吸收波长的差异较大［11］，分别为龙胆苦苷254 nm、马钱苷240 nm、芍药苷230 nm、阿魏酸316 nm、毛蕊花糖苷334 nm。为了使这些成分在一次进样中同时得到测定，本实验设定230、330 nm 检测通道，可有效得到分离。

本实验首先考察了甲醇-0.1% 磷酸、甲醇-0.2%磷酸，最终确定后者作为流动相，此时各成分分离效果最佳，峰型较好。再考察了柱温25、30 ℃，发现龙胆苦苷、马钱苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷在2 种柱温下的分离效果和峰型均较好，但芍药苷仅在25 ℃下峰型理想，故选择柱温为25 ℃。