基于指纹图谱的女金丸质量一致性评价

于凤蕊，林永强，林林，徐丽华

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

女金丸是在明《景岳全书》第六十一卷女金丹方基础上加减而成，处方由当归、白芍、党参、牡丹皮、黄芩等二十三味药组成，具有益气养血，理气活血，止痛的功效，主要用于气血两虚、气滞血瘀所致的月经不调，症见月经提前、月经错后、月经量多、神疲乏力、经水淋漓不净、行经腹痛。

中药指纹图谱是一种多指标的质量控制模式，可以比较全面地反映所含化学成分的种类和数量，表征中药复杂成分与其内在质量的关系，从而反映药品的质量，在中药制剂的质量评价中被广泛应用。女金丸为全原粉入药，本试验分别采用高效液相色谱(HPLC)法和气相色谱(GC)法建立女金丸的指纹图谱，并采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》(2012年版)对2017年国家药品评价性抽验中抽取到的96批次市售女金丸样品进行相似度评价，来考察和评价不同企业之间和同一企业内部女金丸产品质量的一致性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters 2695-2996高效液相色谱仪(美国Waters公司)，二极管阵列检测器；Agilent 7890A气相色谱仪(美国Agilent公司)，FID检测器； Thermo Q Exactive GC高分辨质谱仪(美国Thermo公司)；Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。Milli-QAcademic 超纯水系统(美国默克密理博公司)。

1.2 试剂与试药 甲醇、乙腈为色谱纯，美国天地公司；其余试剂均为分析纯。对照品：芍药苷(110736-201741)、甘草苷(111610-201106)、阿魏酸(110773-201614)、橙皮苷(110721-201115)、黄芩苷(110715-201117)、汉黄芩苷(112002-201702)、黄芩素(111595-200905)、丹皮酚(110708-201407)、甘草酸铵(110731-201418)和汉黄芩素(111514-201304)、桂皮醛(110710-201720)、乙酸龙脑酯(110759-201105)、丹皮酚(110708-201407)、藁本内酯(111737-201608)、α-香附酮(110748-201714)均由中检院提供；芸香柚皮苷(MUST-17030408)由成都曼思特生物科技有限公司提供。女金丸样品为2017年国家药品评价性抽验中抽取到的来自13家生产企业的96批次样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 液相色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，梯度洗脱：0～25 min，10%A～35%A；25～37 min，35%A～59%A；37～40 min，59%A～75%A；波长切换，0～20 min，230 nm；20～40 min，270 nm；体积流量为1 mL·min-1； 柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.1.2 气相色谱条件 色谱柱为HP-5毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，采用程序升温，初始温度50 ℃，保持1 min，以每分钟20 ℃的速率升温至130 ℃，保持10 min；再以每分钟2 ℃的升温速率升至180 ℃，保持1 min；进样口温度230 ℃，检测器温度250 ℃；分流进样，分流比10∶1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 液相指纹图谱供试品溶液的制备 取女金丸样品9 g，精密称定，再精密加入硅藻土4.5 g，混匀，研细，蜜丸精密称取3 g，水蜜丸精密称取1.8 g，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 气相指纹图谱供试品溶液的制备 取女金丸蜜丸9 g，水蜜丸5 g，精密称定，剪碎，置150 mL量瓶中，按照挥发油提取法，自挥发油提取器上端加入乙酸乙酯2 mL，加热提取4 h，分取乙酸乙酯液，用无水硫酸钠脱水，置5 mL量瓶中，用少量乙酸乙酯洗涤无水硫酸钠，合并乙酸乙酯液置5 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1 指纹图谱的建立 按照女金丸的处方，从市场上购买正品药材，经检验合格后，委托济南宏济堂制药股份有限公司按照规定的处方量及工艺生产女金丸样品10批，作为参比制剂使用。

取10批女金丸参比制剂(S1～S10)，按照“2.2”项下方法制备，在“2.1” 项下色谱条件测定，将得到的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)，以S1为参考图谱，时间窗宽度设为0.3 min，自动匹配10批指纹图谱(采用多点校正)，分别形成女金丸HPLC和GC对照指纹图谱。见图1～2。

图1 女金丸HPLC指纹图谱的生成

图2 女金丸GC指纹图谱的生成

2.3.2 指纹图谱中共有峰指认 通过对照药材指认归属、质谱分析初步确认、进一步采用对照品定位确认，将对照指纹色谱图中各色谱峰进行指认。HPLC对照指纹图谱因2、8、9号峰对照品不易获得未通过对照品确认，其余成分均通过对照品定位确认。GC对照指纹图谱1、2、3、4、5、10、11、14、18、21、24、26号峰通过对照品定位确认(见图3～4)。

图3 HPLC对照指纹图谱

图3中，1号峰为芍药苷；3号峰为甘草苷；4号峰为阿魏酸；5号峰为芸香柚皮苷；6号峰为橙皮苷；7号峰为黄芩苷；10号峰为汉黄芩苷；11号峰为桂皮醛；12号峰为黄芩素；13号峰为丹皮酚；14号峰为甘草酸铵；15号峰为汉黄芩素。2、8、9号峰均为黄芩中的成分，分别为不同的糖苷，具体成分待确认。以峰面积最大、色谱分离好、位置居中的7号峰黄芩苷峰作为参照峰。

图4 GC对照指纹图谱

图4中，1号峰为柠檬烯；2号峰为樟脑；3号峰为龙脑；4号峰为桂皮醛；5号峰为乙酸龙脑酯；6号峰为δ-榄香烯；7号峰为β-波旁烯；8号峰为α-愈创木烯；9号峰为β-蛇床烯；10号峰为β-榄香烯；11号峰为丹皮酚；12号峰为大根香叶烯D；13号峰为β-瑟林烯；14号峰为肉豆蔻醚；16号峰为(10),11-愈创木二烯；17号峰为大根香叶烯B；18号峰为表莪术呋喃二烯酮；19号峰为异斯巴醇；21号峰为苍术酮；22号峰为香附烯酮；23号峰为吉马酮；24号峰为藁本内酯；25号峰为Pallidisetin B；26号峰为α-香附酮；27号峰为二氢焦莪术呋喃烯酮；28号峰为1,4-双(1-羟基环己基)-1,3-丁二炔；29号峰为5-羟基菖蒲烯；30号峰为莪术脱酮。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取女金丸参比制剂按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项下色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图，计算各主要峰相对峰面积及相对保留时间的RSD值均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取精密度试验项下的供试品溶液，分别于0、3、6、9、15、18、24 h进行分析，计算。各主要色谱峰相对峰面积及相对保留时间的RSD值均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取女金丸参比制剂(S1)，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，依次分析，计算。各主要色谱峰相对峰面积及相对保留时间的RSD值均小于2%，表明方法重复性良好。

3 样品测定

按照建立的方法对96批次样品进行测定，HPLC和GC指纹图谱相似度测定结果，见图5～6。以不同企业为横坐标，对每个企业样品图谱的相似度的分布情况进行分析，见图7～8。

图5 HPLC指纹图谱相似度测定结果

图6 GC指纹图谱相似度测定结果

图7 HPLC指纹图谱相似度分布情况

图8 GC指纹图谱相似度分布情况

4 结果分析及讨论

女金丸为全原粉入药制剂，工艺简单，因此我们参考标准制剂的理念，购买市售药材，经检验合格后委托生产企业进行加工，得到参比制剂，用于样品的评价。对检验结果进行汇总分析，HPLC指纹图谱的相似度结果主要集中在0.8～1.0，GC指纹图谱的相似度结果主要集中在0.6～0.8，测定结果存在较明显差异。进一步从生产企业的HPLC频数分布图上可以看出，多数企业之间产品质量基本接近，但部分企业不同批次之间产品质量存在显著差异；从生产企业的GC频数分布图上可以看出，多数企业之间产品质量差异显著，而且多数企业不同批次之间产品质量也存在显著差异，说明女金丸产品质量一致性较差。

对原因进行分析，可能存在以下两方面原因：①中药材质量的不稳定性。中药材由于产地及来源的多样性及不确定性，质量可能存在较大差异，从而导致生产的中成药制剂质量存在较大差异；处方中含有多种挥发性药味，该类药材的不稳定性可能是导致企业GC指纹图谱相似度差的原因；②生产工艺的不一致性。作为全原粉入药品种，目前主流的灭菌方式为辐照灭菌，我们采用光释光法对13家生产企业的96批样品进行测定，仅2家企业的10批次样品未经过辐照灭菌，其他86批次样品均采用过辐照灭菌，而我们的委托加工样品未进行过灭菌。女金丸处方中含有多种挥发性药味，辐照灭菌可能对该类药味产生较大影响。原国家食品药品监督管理总局在2015年发布了《中药辐照灭菌技术指导原则》，指出使用60Co-γ射线辐照灭菌产品应全面研究和评估质量、稳定性、生物学性质等方面影响进行，以保证辐照灭菌的必要性、科学性和合理性，但各企业均无相关研究资料。因条件限制，未对自制样品进行辐照处理比较灭菌工艺对产品质量的影响，而各企业样品因处方各药味来源不一致，无法确定质量差异是灭菌工艺导致还是综合因素导致。

中药由于产地分散，生长环境、采收期、加工炮制方法不同及制剂生产工艺等因素，造成不同企业之间、同一企业内部不同批次间内在质量差异。考虑到中药的特殊性，借鉴学习化学仿制药与原研药质量一致性评价方法思路，选择合适的方式评价中药质量一致性，从而保证中药产品的安全、有效，成为目前中药行业亟待解决的问题。