基于辨证保健理论探讨红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症大鼠的影响

刘金莲 张建军 刘曦 张睿 乐娜 张烁 王林元 王淳

辅助降血脂是目前中国保健食品的27个保健功能之一，根据药智网最新数据显示，具有辅助降血脂功能的保健食品共1717种，占所有保健产品的9.8%，经初步统计，其中有近一半以上以中药为原料的产品，这类保健食品安全性比药品高、生物活性比普通食品强，契合了大健康和治未病的发展要求，在养生保健、提高抵抗疾病能力方面发挥着重要的作用，在市场中起主导地位[1]。但是，目前中药类保健食品的应用缺乏中医理论的指导，缺少规范的中医功效评价标准，其适宜人群也没有根据中医证型分类，导致其应用针对性不强，保健作用不能很好的发挥。因此，本实验通过建立脾虚湿盛型高脂血症动物模型，研究红曲茯苓片的健脾祛湿降血脂作用，将中医药辨证理论与辅助降血脂功能相结合，对研发更加安全、有效、精准的中药复方辅助降血脂保健产品具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验药品

红曲茯苓片由山楂5 g(批号：19032223)、葛根5 g(批号：19022113)、白术3 g(批号：19021523)、茯苓5 g(批号：18121516)、红曲1 g(批号：19012151)组成，其中山楂、葛根、白术、茯苓购于北京同仁堂药店；红曲(洛伐他丁0.8%含量)由武汉佳成生物制品有限公司提供，符合GB4926-2008《食品添加剂红曲米(粉)》要求，以上中药经北京中医药大学中医学院科研实验中心李伟副主任药师鉴定。

血脂康(北京北大维信生物科技有限公司，批号： Z10950029)

1.2 实验动物

SPF级雄性健康SD大鼠，体重(180±20) g，购自斯贝福(北京)实验动物科技有限公司[许可证号：SCXK(京)2019-0010]。整个实验过程中大鼠自由饮水，室温20～22℃，相对湿度为60%～70%，灯照周期为12小时，7:00～19:00灯照，19：00～7：00黑暗。

1.3 主要试剂盒

甘油三酯(triglycerides，TG)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：C0612019006)；总胆固醇(total cholesterol，TC)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：C0632019004)；高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：2019003)；低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：2019004)；胃动素(motilin，MTL)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：L191007431)；胃泌素(gastrin，GAS)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：L191007442)；白蛋白(albumin,ALB)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：L191005419 )；醛固酮(aldosterone，ALD)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：L190902584)； 胰蛋白酶(trypsin，TPS)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：L190807291)；血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)试剂盒(优尔生生物科技有限公司，批号：L190828363)；胆碱酯酶(cholinesterase，CHE)试剂盒(南京建成生物科技有限公司,批号：20191028)。

1.4 分组和给药

SD大鼠适应性喂养一周后，随机分为空白组、脾虚湿盛型高脂血症模型组、血脂康组(0.2 g/kg)、红曲茯苓片低剂量组(0.79 g/kg，相当于人9.5 g/天)、红曲茯苓片中剂量组(1.58 g/kg，相当于人19 g/天)、红曲茯苓片高剂量组(4.75 g/kg，相当于人57 g/天)，每组10只。除空白组、模型组外，其余各组大鼠每天上午给予相应药物，灌胃剂量为1 mL/100 g体重，根据体重变化调整灌胃量，空白组、模型组给予相应体积的生理盐水，连续4周。

1.5 造模方法

建立由高脂饲料喂养、饮食不节和游泳劳倦损伤脾气复合因素造脾虚湿盛高脂血症模型。适应性喂养一周后开始造模，造模时间28天：给予高脂饲料(高脂饲料：在维持饲料中添加 20.0%蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠，适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等)并采用每日力竭游泳复合饮食不节(饱食1天，禁食1天，自由饮水)造模，根据《脾虚证动物模型的客观评估》对大鼠脾虚证进行评估，当大鼠出现游泳耐力下降、体重减轻、食量减少、活动减少、安静倦怠、毛色枯槁无光泽等表现时，证明脾虚模型造模成功[2]。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 一般状况 每日观察记录各组大鼠的精神状态、毛发光泽度、二便以及进食量和体重等。

1.6.2 血脂指标 腹主动脉采血，静置2小时后，3000 r/分钟离心15分钟，分离出血清，采用ELISA试剂盒方法测定血清 TC、TG、LDL、HDL 血脂四项水平。

1.6.3 脾虚相关指标 按ELISA试剂盒说明书检测GAS、MTL、TPS、CHE含量。

1.6.4 湿浊相关指标 按ELISA试剂盒说明书检测ALB、ALD、VIP含量。采用免疫组化法测定胃组织AQP3、AQP4，肠组织AQP3、AQP4 蛋白含量。以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，经脱蜡、水化，抗原修复，SABC法染色，脱水、透明、封片、镜检，观察蛋白表达。并用Image-proplus 6.0图像处理在同等条件下检测每张组织切片中表达的平均积分光密度(A)值。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况观察

大鼠适应性喂养期间，各组大鼠毛色、饮食、二便、精神状态等均正常，没有明显差异。造模开始后，模型组大鼠渐渐出现毛色干枯发黄，没有光泽，大便稀溏，精神状态差等情况。给药组大鼠毛发整齐，进食量增加，精神状态良好。

2.2 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠进食量、体重的影响

与空白组相比，复合模型组进食量减少(P<0.01)，与模型组相比，各给药组大鼠进食量显著增加，并逐渐趋于正常(P<0.01)，与血脂康组相比，红曲茯苓片高剂量组进食量增加(P<0.01)。结果见表1。

表1 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠进食量的影响

实验开始第 1 天各组大鼠之间体质量无显著性差异(P>0.05)。实验第14、28天，复合模型组大鼠体质量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。造模结束后，各给药组大鼠体质量均有增加，以血脂康组、红曲茯苓片高剂量组体质量增加显著，差异有统计学意义(P<0.01)，结果见表2。

表2 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠体重的影响

2.3 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠血脂的影响

与空白组相比，模型组大鼠TG、TC、LDL-C含量升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，HDL-C水平变化不显著(P>0.05)。

与模型组相比，各给药组大鼠TG含量均有一定程度的降低，血脂康组、红曲茯苓片低、中、高剂量组差异显著(P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01)。各给药组大鼠TC含量均有一定程度的变化，血脂康组、红曲茯苓片高剂量组显著降低(P<0.05)。各给药组大鼠LDL含量均有一定程度的降低，血脂康组、红曲茯苓片高剂量组显著降低(P<0.05、P<0.01)。各给药组大鼠HDL含量均显著升高(P<0.05)。

与血脂康组相比，红曲茯苓片低、中剂量组TC含量增加(P<0.01、P<0.05)，红曲茯苓片高剂量组LDL含量降低(P<0.05)。结果见表3。

表3 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠血脂的影响

2.4 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠血清中脾虚相关指标的影响

与空白组相比，复合模型组大鼠GAS、MTL、TPS含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，CHE升高(P<0.05)。

与模型组相比，各给药组大鼠GAS水平均增加(P<0.01)。各给药组除红曲茯苓片低剂量组差异不显著外，其余组MTL水平均升高，即血脂康组、红曲茯苓片中、高剂量组(P<0.01)，各给药组大鼠TPS水平均有一定程度的升高(P<0.01)。各给药组大鼠CHE水平均降低(P<0.05,P<0.01)。但其中血脂康组、红曲茯苓片低剂量组结果接近(P<0.05)，红曲茯苓片中、高剂量组差异更为显著(P<0.01)。

与血脂康组相比，红曲茯苓片中、高剂量组GAS含量增加(P<0.01)，高剂量组MTL含量增加(P<0.01)，低剂量组TPS含量减少(P<0.05)。结果见表4。

表4 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠GAS、MTL、TPS、CHE的影响

2.5 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠血清中湿浊相关指标的影响

与空白组相比，模型组大鼠ALB水平降低(P<0.01)，ALD水平升高(P<0.05)，VIP水平升高(P<0.05)。

与模型组比，各给药组大鼠ALB水平均有升高趋势，其中红曲茯苓片中、高剂量组明显增加(P<0.05)，各给药组大鼠ALD水平均有相应的变化，差异不显著，红曲茯苓片高剂量组ALD水平显著降低(P<0.05)，各给药组大鼠VIP水平均降低，有统计学意义(P<0.05)。结果见表5。

表5 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠ALB、ALD、VIP的影响

与空白组相比，复合模型组大鼠胃、肠组织中AQP3 水平均显著性降低(P<0.01)，AQP4 水平均显著性升高(P<0.01)。

与模型组相比，各给药组大鼠胃组织AQP3 水平均有一定程度的增加(P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01)，肠组织AQP3 水平也有不同程度的提高(P<0.01)。各给药组大鼠胃组织AQP4水平均有一定程度的降低，其中血脂康组和红曲茯苓片高剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。各给药组大鼠肠组织AQP4水平也有不同程度的下降，血脂康组、红曲茯苓片中、高剂量组差异显著(P<0.01)。

与血脂康相比，红曲茯苓片低、中、高剂量组能增加肠AQP3含量(P<0.01)，增加AQP4含量(P<0.01)，结果见表6、图1～4。

表6 红曲茯苓片对脾虚湿盛型高脂血症复合模型大鼠胃、肠组织AQP3、AQP4 的影响

注： A:空白组；B:复合模型组；C:血脂康组；D：红曲茯苓片低剂量组；E：红曲茯苓片中剂量组；F：红曲茯苓片高剂量组。

注： A:空白组；B:复合模型组；C:血脂康组；D：红曲茯苓片低剂量组；E：红曲茯苓片中剂量组；F：红曲茯苓片高剂量组。

注： A:空白组；B:复合模型组；C:血脂康组；D：红曲茯苓片低剂量组；E：红曲茯苓片中剂量组；F：红曲茯苓片高剂量组。

3 讨论

高脂血症在中国的发病率已经达到20%，成年人中血脂异常的患者接近1.6亿[3]。血脂异常发生的过程较缓慢、隐匿性强，发展初期大多数人并无明显症状和体征，不易被察觉，且长时间的血脂异常波动是诱发心脑血管等疾病的重要危险因素，严重威胁着人类的健康。中医将高脂血症归为“脂”“膏”“浊”等范畴，“膏”“浊”也是湿邪的一种，湿为浊之渐，高脂血症也属湿浊性质。湿困脾胃，脾虚精微不化，痰湿内生。脾虚与湿浊相互影响，恶性循环，瘀阻于血脉，血液运行不畅，清浊不分而发为血脂异常。有学者通过对 351 例血脂异常患者的中医临床证候类型研究发现，脾虚痰湿证所占比例最大[4]。因此本实验研究的是最为常见的脾虚湿盛型高脂血症。

红曲茯苓片是以中医基础理论为指导，根据临床治疗的经验经中医药专家科学论证，结合近年来的研究进展，针对血脂异常属于中医脾虚湿盛证型的人群以健脾祛湿、化浊降脂为保健法则总结创制而成的治疗脾虚湿盛型血脂异常的全新复方，主要由红曲、白术、茯苓、山楂、葛根 5 味药物组成。红曲具有健脾消食、活血化瘀、化浊降脂之功，可用于脾虚失运、痰浊阻滞、血瘀阻络的血脂异常。白术健脾益气，燥湿利水，用于脾虚食少，消化不良，二者配伍，健运脾胃，燥化湿浊，标本兼治，用为君药。茯苓有渗湿、健脾之功。山楂消食健胃，行气散瘀，对高脂血症有很好的治疗作用，二者同用，能增强君药的健脾燥湿，消食化积、化浊降脂之功。葛根与白术、茯苓同用，增强健脾助运、升发清阳之功，全方合理配伍，健脾祛湿化浊以治病求本，降低血脂；并能活血散瘀以防患未然，通利血脉。以健脾祛湿，化浊降脂立法，切中病机，标本兼治。其中茯苓、山楂、葛根既是食品又是药品，红曲、白术可用于保健食品的真菌及中药，符合中国现行法规对保健食品原料的要求[5]。根据红曲茯苓片组成药物的药性药效及其主要的功能主治，基于“方证相应”的理论可知红曲茯苓片可应用于脾虚湿盛证，因此在保健食品功能评价所用脂代谢紊乱模型[6]基础上建立脾虚湿盛证动物模型，通过饱食一天、禁食一天模拟人体饮食不节，结合力竭游泳导致劳倦过度，饮食不节、劳倦过度则导致脾气虚弱，脾失健运，水谷精微不归正化，则津液代谢异常、浊脂内生，以此建立脾虚湿盛证候。本实验选取的阳性对照药为血脂康胶囊，是中药红曲的提取物，同样具有化浊降脂、活血化瘀、健脾消食的中医功效，因其疗效确切，不良反应少，被广泛用于高脂血症。因此，以血脂康对比研究中药复方健脾祛湿降脂作用。

GAS、MTL、TPS、CHE是评价脾胃功能的客观指标[7-13]。陈贵堂[14]研究发现黄连温胆汤能提高患者MTL、GAS水平改善脾胃湿热型胃痞病患者纳呆、腹部不适、嗳气等胃肠道症状。TPS为肽链内切酶，有学者认为脾虚与该酶活性关系密切[12]。当机体处于脾虚状态时，GAS、MTL、TPS水平降低。结果表明红曲茯苓片中、高剂量组对于GAS改善优于血脂康组，且高剂量组对于MTL的改善优于血脂康组。CHE是临床研究中的重要指标，该酶有调节胃肠消化蠕动的能力，部分临床医生在进行血清生化指标检查中发现当患者TC、TG等水平升高时，CHE活性也有明显增加，将其作为临床检测脂肪肝的重要指标[15]，CHE水平可以同时反映血脂和脾虚的变化。实验结果表明，红曲茯苓片低、中、高剂量组都能降低CHE水平。这说明红曲茯苓片和血脂康都能发挥健脾功效，但红曲茯苓片中、高剂量组健脾作用更强。复方中红曲健脾消食，白术健脾益气，茯苓亦能健脾，三者配伍，共同发挥健运脾胃的功效。

ALB是血浆中含量最多的蛋白质，可维持血液胶体渗透压。临床研究中常将ALB作为判定水液代谢(水肿)发生的一个指标[16]。本实验模型组ALB水平较空白组显著下降，给予红曲茯苓片调节后，该指标含量较模型组显著增加。说明体内水液或湿邪偏重时，红曲茯苓片可改善中医湿盛证候，为脾虚湿盛证型研究的生化指标提供意见。ALD、VIP是参与水液代谢的重要激素[17]。脾虚湿盛模型大鼠ALD、VIP水平升高，可能与水液代谢紊乱相关，提示体内湿邪偏盛，给予三个剂量组的红曲茯苓片进行预防后，ALD、VIP水平均有不同程度的降低，高剂量组差异显著，表明红曲茯苓片有祛除机体水湿之邪、调节水液代谢作用。但血脂康对湿浊指标中ALB、ALD无明显改善，说明复方对于改善湿盛症状效果更佳，复方中茯苓健脾渗湿、白术健脾燥湿，二者共同发挥祛湿的作用。水通道蛋白(AQPs)是参与体内水液代谢的一类蛋白，对维持机体水代谢稳态及细胞膜的水传输有着重要意义[18]，中医认为“湿”即水液的一部分，因此，该指标可作为研究中医与“湿”相关证候的基础。结果表明模型组胃、肠组织AQP3表达量下降，血脂康组及红曲茯苓片低、中、高剂量组均增加，模型组胃、肠AQP4表达量增加，血脂康组及红曲茯苓片低、中、高剂量组AQP4水平基本下降，尤以血脂康组及红曲茯苓片高剂量组更为明显，说明AQP3、AQP4与红曲茯苓片祛湿作用的机制关系密切。红曲茯苓片改善肠组织AQP3水平优于血脂康组，但血脂康组改善肠组织AQP4水平优于红曲茯苓片组，机制有待进一步研究。针对以上“湿浊”指标，通过本实验研究结果可以发现红曲茯苓片在健脾基础上，还可以通过抑制VIP水平，提高ALB活性，改善AQP蛋白含量，达到祛除浊邪的作用。

综上，对脾虚湿盛型高脂血症，红曲茯苓片和血脂康都具有辅助降血脂功能，但红曲茯苓片相比血脂康在健脾祛湿方面效果更加全面。既能有效调节脾胃运化、缓解脾胃虚弱，又能健脾祛湿，祛除浊邪。

随着社会的进步，饮食结构生活方式的改变，疾病谱和医学模式发生了变化，人们的亚健康状况日益增多，大健康理念深入人心，“辨证保健”是社会发展的大趋势，将防治重心前移，在疾病早期根据人的体质进行干预，精准保健，可防患于未然，中药类保健食品所用原料与中成药相比具有更高的安全性，其产品安全有效，适宜人群定位为疾病初期指标已显异常、症状尚为轻浅的人群，符合保健的需求。本研究基于辨证保健的理念，采用高脂饲料喂养、饮食不节和游泳劳倦损伤脾气复合因素造脾虚湿盛高脂血症模型，研究红曲茯苓片对功能、功效复合模型的降血脂作用和健脾，祛湿功效为精准保健，提高效果提供实验依据，为进一步进行中医辨证分型的人体试验研究、评价提供借鉴。