复方苁蓉精水提液对帕金森病模型大鼠中脑GSK-3β表达的影响

肖绍坚 王志汕 陈诗雅 林友宁 钟佳男

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)其特征性的病理变化是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡和路易小体(其主要成分是错误折叠的a-synuclein)的出现[1]。而a-synuclein是糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)的下游蛋白，二者与PD的发病密切相关。GSK-3β作为一种多功能的丝氨酸/酪氨酸，其活化与神经元凋亡的增加直接相关[2-3]。近年的研究表明[4-5]，GSK-3β活性增加会导致DA含量显著的减少、凋亡，而抑制GSK-3β的活性，能阻断DA的的减少、变性、凋亡，改善和治疗PD模型大鼠的症状。

PD属于中医“颤证”范畴。《素问·至真要大论篇》云：“男子七八，肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极。”故帕金森病的病位虽在筋骨，但是病性是本虚标实。肝肾阴虚、脑髓不足是PD最根本病机。所以，临床治疗PD应以补肝肾，益脑髓为基础。临床试验均表明以补肾中药为主的方药对PD的治疗有一定作用。肉苁蓉中主要有效成分松果菊苷可以影响大鼠海马区GSK-3β蛋白的表达，对PD有一定的治疗作用[6]。淫羊藿提取物淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号通路来抑制GSK-3β的活性，减少tau蛋白过度磷酸化，从而保护细胞调亡[7]。同时，肉苁蓉、淫羊藿都有抑制GSK-3β活性，减少α-syn的聚集，从而减轻多巴胺神经元的凋亡[8]的作用。本实验通过观察复方苁蓉精水提液对PD大鼠行为学和中脑GSK-3β表达的影响，继而探讨复方苁蓉精水提液治疗PD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验取50只SD健康雄性大鼠，每只大鼠的体重为(180±20)g，年龄为6周龄，由福建中医药大学实验动物中心提供。饲养条件：福建中医药大学实验动物中SPF级动物饲养室，室温(20～22)℃，自动光暗控制，光暗各12小时，觅食、饮水自由。

1.2 药物与试剂

复方苁蓉精水提液的药物组成为：肉苁蓉30 g、淫羊藿30 g、制黄精54 g。由福建中医药大学附属第三人民医院中药房提供，将上述药物粉碎，取蒸馏水(约为药材体积10倍)，浸泡1小时，加热回流2小时，过滤收集水提液。重复上述操作，合并两次水提液，于旋转蒸发仪中浓缩，最终得到浓度分别为25、50、100 mg/mL的复方苁蓉精水提液。

葵花油乳液(美国Sigma公司)，鱼藤酮(批号：R8875)，GSK-3β蛋白(美国Cell Sign-alingTeehnolegy公司)，粉末型磷酸盐缓冲液(福建福州迈新)，粉末型抗原修复液(柠檬酸法)，乙醇、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 实验仪器

光学显微镜(型号：MDL)，倒置显微镜(型号：TS100，日本尼康公司)，石蜡切片机(型号：C6，德国LEICA公司)。

1.4 动物分组及模型制备

将50只大鼠随机分为2组，其中正常组10只，造模组40只。本试验使用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液来建立大鼠的PD模型。每天按比例给大鼠注射1.5 mg/mL的鱼藤酮葵花油乳液0.1 mL/100 g，注射前给大鼠称重，连续给药14天。正常组不予处理。造模过程中由于大鼠的个体差异，共8只大鼠死亡，剩下32只大鼠造模成功。把造模成功的大鼠随机分为4组，即模型组、复方苁蓉精水提液高、中、低剂量组，每组各8只。然后，按PD患者每日复方苁蓉精水提液的常用剂量为47 g来计算，以人和大鼠的体表面积比公式进行换算，则大鼠每天用药的低、中、高剂量分别为40、80、160 mg/kg，其中人的临床等效剂量为中剂量。故复方苁蓉精水提液低、中、高剂量组分别用浓度为25、50、100 mg/mL的复方苁蓉精水提液，以10 mL/(kg·d)给大鼠灌胃，连续14天。正常组及模型组给予10 mL/(kg·d)的生理盐水灌胃，频次同复方苁蓉精水提液组。

1.5 行为学检测

对各组大鼠的精神状态、觅食饮水、行为表现、活动状况等进行观察，记录。各组大鼠在实验干预第14天灌胃后的6小时，分别进行悬挂实验[9]：将大鼠的前爪悬挂在水平放置的金属丝上，金属丝距离地面约30 cm，记录大鼠从开始悬挂到落地之间的时间。根据记录时间进行评分：持续0～5秒为0分，6～10秒为1分，11～15秒为2分，16～20秒为3分，21～25秒为4分，26～30秒为5分，超过30秒为6分。每次间隔约2分钟测一次，共测3次，取其平均值。

1.6 实验取材

最后一次给药12小时后，从各组大鼠中随机抽取6只，并用乙醚麻醉，随后断头处理，在冰盘上提取大鼠中脑黑质，用冰0.9%氯化钠溶液来反复冲洗脑组织表面的血液，待其干净后，拿滤纸吸干脑组织表面的残余液体，包埋脑组织，制备成石蜡切片，置于4℃冰箱保存。

1.7 免疫荧光检测中脑GSK-3β的表达情况

1.7.1 免疫荧光染色 将石蜡包埋好的大鼠大脑组织连续冠状切片，切片的厚度约为5 μm，载玻片附贴组织切片，于4℃冰箱长期保存。将石蜡切片取出，置于60℃恒温箱1小时，此后依次置于二甲苯和不同浓度的无水乙醇浸泡，最后放入蒸馏水中(通风橱中进行)。之后，将石蜡切片用柠檬酸抗原修复液和PBS漂洗，再用50 μL山羊封闭血清，向每个脑组织滴加50 μL GSK-3β抗体(抗体原液提前用1%BSA配置并稀释，抗体与抗体稀释液比例为1∶1000，于-20℃长期保存)，4℃孵育过夜至少20小时。次日，PBS漂洗后，向每个大脑组织切片滴加50 μL免疫荧光二抗(用1%牛血清白蛋白稀释，抗体原液：抗体稀释液为1∶500)，37℃保湿盒孵育2小时，注意操作时避光，取出置于洗片盒，再次PBS漂洗，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色剂。用抗荧光淬灭封片剂对其封片，若不及时拍片可4℃避光保存，3天内进行荧光拍片。

1.7.2 镜检拍照及数据分析 荧光显微镜下观察并采集图像。(异硫氰酸荧光素绿光激发波长465～495 nm，发射波长515～555 nm；蓝光发射波长为435～490 nm)，选择3张切片，选取海马及黑质视野下分别采集图像，每张图像随机选取三个等大正方形区域，采用Image-Pro Plus图像分析系统进行半定量分析，记录各组大鼠视野内的平均光密度，并对此进行统计分析。拍摄时蓝光显色为DAPI；绿光显色为GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)指标；Merge为绿光蓝光叠加态。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况比较

造模前各组大鼠的体型大小、毛发色泽、活动情况均无明显差异。模型组大鼠在造模第7天开始逐渐出现活动减少、觅食行为减弱、躲避、弓背向上抬高、步履蹒跚等现象。复方苁蓉精水提液干预组的大鼠主动活动均较模型组大鼠有所增加，毛发的色泽较亮丽，行动有所改善，复方苁蓉精水提液的低、中、高剂量各组之间，大鼠一般情况无明显差异。正常组的大鼠毛色亮，饮食、活动均正常。

2.2 行为学结果比较

复方苁蓉精水提液干预后第14天，与正常组比较，模型组悬挂实验评分减少，差异有统计学意义(P<0.05)；给药第14天后，与模型组比较，复方苁蓉精水提液的中剂量和高剂量组悬挂实验行为学评分增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 复方苁蓉精水提液干预前后各组大鼠悬挂评分比较

2.3 免疫荧光法检测GSK-3β表达情况

结果显示，在大鼠黑质部，正常组与模型组大鼠之间GSK-3β平均光密度存在差异，有统计学意义(P<0.05)。与正常组大鼠相比，模型组及治疗组大鼠的GSK-3β平均光密度较高(P<0.05)。与模型组大鼠相比，复方苁蓉精水提液的中、高剂量大鼠平均光密度较低(P<0.05)；低剂量组大鼠平均光密度和模型组平均光密度差异无统计学意义(P<0.05)。该结果提示，经鱼藤酮造模后，大鼠黑质部位GSK-3β表达显著增多；经复方苁蓉精水提液治疗14天后，GSK-3β表达较模型组降低，表明复方苁蓉精水提液在黑质部位具有一定的抑制GSK-3β表达的作用。见表2、图1。

表2 复方苁蓉精水提液干预前后各组大鼠大脑黑质GSK-3β平均光密度的比较

图1 各组大鼠大脑黑质GSK-3β表达情况(×400)

3 讨论

PD是一种进行性神经退行性病变，有证据表明，GSK-3β活性表达，可引起tau蛋白磷酸化，a-synuclein聚集[10]。本实验发现经复方苁蓉精水提液干预后，大鼠中脑黑质GSK-3β的表达减少，这也进一步验证了相关实验得出的结果:通过抑制GSK-3β的活性，进而抑制tau蛋白的过磷酸化，从而抑制黑质神经元凋亡[10]。也说明了复方苁蓉精水提液可以抑制GSK-3β的活性，继而对神经细胞起到了保护的作用。

对于PD模型大鼠肢体运动协调情况的观察，一般用悬挂实验来作为行为学检测方法[11]，本实验通过对造模组大鼠的活动能力与行为等方面进行观察，结果表明，模型组出现活动减少、觅食、躲避行为减弱等情况，这与临床帕金森患者活动障碍的症状相似，并且模型组的悬挂实验评分较正常组明显减少。同时，复方苁蓉精水提液中剂量和高剂量组的悬挂实验评分较模型组增加。这与课题组的前期的实验结果相吻合，即将PD患者分组，其中对照组予卡左双多巴控释片治疗，治疗组在予卡左双多巴控释片治疗的基础上，再加上苁蓉精(肉苁蓉、淫羊藿、黄精组成)，结果显示苁蓉精联合卡左双多巴控释片的治疗方案对于早期的PD人可明显改善中医证候评分[12]。这说明，复方苁蓉精水提液对于PD模型大鼠的行为障碍能起到改善、治疗的作用。

中医认为，PD位在肝肾，病机在于髓海空虚，脏腑之气渐衰。因肝肾亏虚，故而筋脉失荣，症见肢体震颤。本病属虚实夹杂，本虚标实，既往研究提出“肝—肾—脑轴”功能失调假说[13]，认为肾虚为其本，肝风为其标，滋补肾精法是其基本治法，所谓乙葵同源，补肾填精，精足可化血，滋水以涵木，肝风自息，而帕金森所表现的标实，即震颤以及运动障碍等症状也得以改善。所以，在此理论指导下，复方苁蓉精以此组方——肉苁蓉为君，有温补肾阳、补益精血之效；淫羊藿为臣，奏补肾温阳、强筋壮骨之用；黄精为使，起补肾滋阴、填精益髓之效，三药共奏补肾填精，健脑益髓之功效，该方已申请并获得国家授权专利(专利号：201110302854.1)。因此，也有学者如滕龙等[14]人通过复方地黄方干预注射MPTP制成的PD大鼠模型的实验，其结果表明GSK-3β蛋白的激活如果被缓解，β-catenin 磷酸化作用会减弱，可以减少a-synuclein异常聚集及错误折叠，影响细胞凋亡，从而缓解PD异动证。这与课题前期的研究发现相符，也发现肉苁蓉、淫羊藿等补肾中药可改善PD模型动物脑内DA的含量，减少Bax的表达，增加bcl-2的表达，降低caspase-3的活性，保护DA能神经元的损伤[8]，也就为中西医结合临床防治PD提供依据。

综上，复方苁蓉精水提液能够提高PD模型大鼠中脑黑质DA的含量，改善其行为学障碍，其机制可能是通过抑制GSK-3β的激活，来降低tau蛋白的磷酸化，减少a-synuclein及Bax的表达，增加Bcl-2的表达来减轻DA能神经元的损伤，从而对DA能神经元起到保护作用。