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复方苁蓉精水提液对帕金森病模型大鼠中脑GSK-3β表达的影响

2021-01-05肖绍坚王志汕陈诗雅林友宁钟佳男

环球中医药 2020年11期
关键词:光密度提液黑质

肖绍坚 王志汕 陈诗雅 林友宁 钟佳男

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)其特征性的病理变化是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡和路易小体(其主要成分是错误折叠的a-synuclein)的出现[1]。而a-synuclein是糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的下游蛋白,二者与PD的发病密切相关。GSK-3β作为一种多功能的丝氨酸/酪氨酸,其活化与神经元凋亡的增加直接相关[2-3]。近年的研究表明[4-5],GSK-3β活性增加会导致DA含量显著的减少、凋亡,而抑制GSK-3β的活性,能阻断DA的的减少、变性、凋亡,改善和治疗PD模型大鼠的症状。

PD属于中医“颤证”范畴。《素问·至真要大论篇》云:“男子七八,肝气衰,筋不能动,天癸竭,精少,肾藏衰,形体皆极。”故帕金森病的病位虽在筋骨,但是病性是本虚标实。肝肾阴虚、脑髓不足是PD最根本病机。所以,临床治疗PD应以补肝肾,益脑髓为基础。临床试验均表明以补肾中药为主的方药对PD的治疗有一定作用。肉苁蓉中主要有效成分松果菊苷可以影响大鼠海马区GSK-3β蛋白的表达,对PD有一定的治疗作用[6]。淫羊藿提取物淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号通路来抑制GSK-3β的活性,减少tau蛋白过度磷酸化,从而保护细胞调亡[7]。同时,肉苁蓉、淫羊藿都有抑制GSK-3β活性,减少α-syn的聚集,从而减轻多巴胺神经元的凋亡[8]的作用。本实验通过观察复方苁蓉精水提液对PD大鼠行为学和中脑GSK-3β表达的影响,继而探讨复方苁蓉精水提液治疗PD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验取50只SD健康雄性大鼠,每只大鼠的体重为(180±20)g,年龄为6周龄,由福建中医药大学实验动物中心提供。饲养条件:福建中医药大学实验动物中SPF级动物饲养室,室温(20~22)℃,自动光暗控制,光暗各12小时,觅食、饮水自由。

1.2 药物与试剂

复方苁蓉精水提液的药物组成为:肉苁蓉30 g、淫羊藿30 g、制黄精54 g。由福建中医药大学附属第三人民医院中药房提供,将上述药物粉碎,取蒸馏水(约为药材体积10倍),浸泡1小时,加热回流2小时,过滤收集水提液。重复上述操作,合并两次水提液,于旋转蒸发仪中浓缩,最终得到浓度分别为25、50、100 mg/mL的复方苁蓉精水提液。

葵花油乳液(美国Sigma公司),鱼藤酮(批号:R8875),GSK-3β蛋白(美国Cell Sign-alingTeehnolegy公司),粉末型磷酸盐缓冲液(福建福州迈新),粉末型抗原修复液(柠檬酸法),乙醇、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 实验仪器

光学显微镜(型号:MDL),倒置显微镜(型号:TS100,日本尼康公司),石蜡切片机(型号:C6,德国LEICA公司)。

1.4 动物分组及模型制备

将50只大鼠随机分为2组,其中正常组10只,造模组40只。本试验使用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液来建立大鼠的PD模型。每天按比例给大鼠注射1.5 mg/mL的鱼藤酮葵花油乳液0.1 mL/100 g,注射前给大鼠称重,连续给药14天。正常组不予处理。造模过程中由于大鼠的个体差异,共8只大鼠死亡,剩下32只大鼠造模成功。把造模成功的大鼠随机分为4组,即模型组、复方苁蓉精水提液高、中、低剂量组,每组各8只。然后,按PD患者每日复方苁蓉精水提液的常用剂量为47 g来计算,以人和大鼠的体表面积比公式进行换算,则大鼠每天用药的低、中、高剂量分别为40、80、160 mg/kg,其中人的临床等效剂量为中剂量。故复方苁蓉精水提液低、中、高剂量组分别用浓度为25、50、100 mg/mL的复方苁蓉精水提液,以10 mL/(kg·d)给大鼠灌胃,连续14天。正常组及模型组给予10 mL/(kg·d)的生理盐水灌胃,频次同复方苁蓉精水提液组。

1.5 行为学检测

对各组大鼠的精神状态、觅食饮水、行为表现、活动状况等进行观察,记录。各组大鼠在实验干预第14天灌胃后的6小时,分别进行悬挂实验[9]:将大鼠的前爪悬挂在水平放置的金属丝上,金属丝距离地面约30 cm,记录大鼠从开始悬挂到落地之间的时间。根据记录时间进行评分:持续0~5秒为0分,6~10秒为1分,11~15秒为2分,16~20秒为3分,21~25秒为4分,26~30秒为5分,超过30秒为6分。每次间隔约2分钟测一次,共测3次,取其平均值。

1.6 实验取材

最后一次给药12小时后,从各组大鼠中随机抽取6只,并用乙醚麻醉,随后断头处理,在冰盘上提取大鼠中脑黑质,用冰0.9%氯化钠溶液来反复冲洗脑组织表面的血液,待其干净后,拿滤纸吸干脑组织表面的残余液体,包埋脑组织,制备成石蜡切片,置于4℃冰箱保存。

1.7 免疫荧光检测中脑GSK-3β的表达情况

1.7.1 免疫荧光染色 将石蜡包埋好的大鼠大脑组织连续冠状切片,切片的厚度约为5 μm,载玻片附贴组织切片,于4℃冰箱长期保存。将石蜡切片取出,置于60℃恒温箱1小时,此后依次置于二甲苯和不同浓度的无水乙醇浸泡,最后放入蒸馏水中(通风橱中进行)。之后,将石蜡切片用柠檬酸抗原修复液和PBS漂洗,再用50 μL山羊封闭血清,向每个脑组织滴加50 μL GSK-3β抗体(抗体原液提前用1%BSA配置并稀释,抗体与抗体稀释液比例为1∶1000,于-20℃长期保存),4℃孵育过夜至少20小时。次日,PBS漂洗后,向每个大脑组织切片滴加50 μL免疫荧光二抗(用1%牛血清白蛋白稀释,抗体原液:抗体稀释液为1∶500),37℃保湿盒孵育2小时,注意操作时避光,取出置于洗片盒,再次PBS漂洗,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色剂。用抗荧光淬灭封片剂对其封片,若不及时拍片可4℃避光保存,3天内进行荧光拍片。

1.7.2 镜检拍照及数据分析 荧光显微镜下观察并采集图像。(异硫氰酸荧光素绿光激发波长465~495 nm,发射波长515~555 nm;蓝光发射波长为435~490 nm),选择3张切片,选取海马及黑质视野下分别采集图像,每张图像随机选取三个等大正方形区域,采用Image-Pro Plus图像分析系统进行半定量分析,记录各组大鼠视野内的平均光密度,并对此进行统计分析。拍摄时蓝光显色为DAPI;绿光显色为GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)指标;Merge为绿光蓝光叠加态。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况比较

造模前各组大鼠的体型大小、毛发色泽、活动情况均无明显差异。模型组大鼠在造模第7天开始逐渐出现活动减少、觅食行为减弱、躲避、弓背向上抬高、步履蹒跚等现象。复方苁蓉精水提液干预组的大鼠主动活动均较模型组大鼠有所增加,毛发的色泽较亮丽,行动有所改善,复方苁蓉精水提液的低、中、高剂量各组之间,大鼠一般情况无明显差异。正常组的大鼠毛色亮,饮食、活动均正常。

2.2 行为学结果比较

复方苁蓉精水提液干预后第14天,与正常组比较,模型组悬挂实验评分减少,差异有统计学意义(P<0.05);给药第14天后,与模型组比较,复方苁蓉精水提液的中剂量和高剂量组悬挂实验行为学评分增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 复方苁蓉精水提液干预前后各组大鼠悬挂评分比较

2.3 免疫荧光法检测GSK-3β表达情况

结果显示,在大鼠黑质部,正常组与模型组大鼠之间GSK-3β平均光密度存在差异,有统计学意义(P<0.05)。与正常组大鼠相比,模型组及治疗组大鼠的GSK-3β平均光密度较高(P<0.05)。与模型组大鼠相比,复方苁蓉精水提液的中、高剂量大鼠平均光密度较低(P<0.05);低剂量组大鼠平均光密度和模型组平均光密度差异无统计学意义(P<0.05)。该结果提示,经鱼藤酮造模后,大鼠黑质部位GSK-3β表达显著增多;经复方苁蓉精水提液治疗14天后,GSK-3β表达较模型组降低,表明复方苁蓉精水提液在黑质部位具有一定的抑制GSK-3β表达的作用。见表2、图1。

表2 复方苁蓉精水提液干预前后各组大鼠大脑黑质GSK-3β平均光密度的比较

图1 各组大鼠大脑黑质GSK-3β表达情况(×400)

3 讨论

PD是一种进行性神经退行性病变,有证据表明,GSK-3β活性表达,可引起tau蛋白磷酸化,a-synuclein聚集[10]。本实验发现经复方苁蓉精水提液干预后,大鼠中脑黑质GSK-3β的表达减少,这也进一步验证了相关实验得出的结果:通过抑制GSK-3β的活性,进而抑制tau蛋白的过磷酸化,从而抑制黑质神经元凋亡[10]。也说明了复方苁蓉精水提液可以抑制GSK-3β的活性,继而对神经细胞起到了保护的作用。

对于PD模型大鼠肢体运动协调情况的观察,一般用悬挂实验来作为行为学检测方法[11],本实验通过对造模组大鼠的活动能力与行为等方面进行观察,结果表明,模型组出现活动减少、觅食、躲避行为减弱等情况,这与临床帕金森患者活动障碍的症状相似,并且模型组的悬挂实验评分较正常组明显减少。同时,复方苁蓉精水提液中剂量和高剂量组的悬挂实验评分较模型组增加。这与课题组的前期的实验结果相吻合,即将PD患者分组,其中对照组予卡左双多巴控释片治疗,治疗组在予卡左双多巴控释片治疗的基础上,再加上苁蓉精(肉苁蓉、淫羊藿、黄精组成),结果显示苁蓉精联合卡左双多巴控释片的治疗方案对于早期的PD人可明显改善中医证候评分[12]。这说明,复方苁蓉精水提液对于PD模型大鼠的行为障碍能起到改善、治疗的作用。

中医认为,PD位在肝肾,病机在于髓海空虚,脏腑之气渐衰。因肝肾亏虚,故而筋脉失荣,症见肢体震颤。本病属虚实夹杂,本虚标实,既往研究提出“肝—肾—脑轴”功能失调假说[13],认为肾虚为其本,肝风为其标,滋补肾精法是其基本治法,所谓乙葵同源,补肾填精,精足可化血,滋水以涵木,肝风自息,而帕金森所表现的标实,即震颤以及运动障碍等症状也得以改善。所以,在此理论指导下,复方苁蓉精以此组方——肉苁蓉为君,有温补肾阳、补益精血之效;淫羊藿为臣,奏补肾温阳、强筋壮骨之用;黄精为使,起补肾滋阴、填精益髓之效,三药共奏补肾填精,健脑益髓之功效,该方已申请并获得国家授权专利(专利号:201110302854.1)。因此,也有学者如滕龙等[14]人通过复方地黄方干预注射MPTP制成的PD大鼠模型的实验,其结果表明GSK-3β蛋白的激活如果被缓解,β-catenin 磷酸化作用会减弱,可以减少a-synuclein异常聚集及错误折叠,影响细胞凋亡,从而缓解PD异动证。这与课题前期的研究发现相符,也发现肉苁蓉、淫羊藿等补肾中药可改善PD模型动物脑内DA的含量,减少Bax的表达,增加bcl-2的表达,降低caspase-3的活性,保护DA能神经元的损伤[8],也就为中西医结合临床防治PD提供依据。

综上,复方苁蓉精水提液能够提高PD模型大鼠中脑黑质DA的含量,改善其行为学障碍,其机制可能是通过抑制GSK-3β的激活,来降低tau蛋白的磷酸化,减少a-synuclein及Bax的表达,增加Bcl-2的表达来减轻DA能神经元的损伤,从而对DA能神经元起到保护作用。

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