毓麟珠通过影响免疫性POI小鼠卵母细胞线粒体改善卵巢功能的研究

杨珍 魏茂林 董晓英

线粒体是细胞中重要的能量工厂，与细胞中的各种生命活动息息相关，其功能异常经常伴随着各种人类疾病及衰老的发生。生殖衰老严重危害了女性的生殖和心理健康。卵巢是女性生殖衰老的敏感器官，卵巢中正常的卵泡数量和卵母细胞完成减数分裂是雌性维持正常生育能力的先决条件。当卵巢中的原始卵泡消耗殆尽后，女性将会失去生育功能。女性卵巢功能因卵泡的不正常消耗出现卵巢储备功能下降，逐步加重变成卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，最终变成不可逆转的卵巢早衰。因此，尽早发现POI对其进行干预可以防止卵巢早衰的发生[1]。研究发现，线粒体功能异常与卵巢衰老密切相关[2]。卵巢衰老主要表现为卵母细胞数量减少和质量下降, 伴随卵母细胞线粒体数量减少、结构改变及产能降低, 线粒体成为了卵巢衰老的决定因素, 改善卵母细胞质量主要是通过改善线粒体功能和增加线粒体数量[3]。西医的线粒体补充治疗仍存在较大争议，至今无法广泛应用于临床[4]。而中药在治疗POI中发挥着重要的作用，从改善卵泡治疗到体外受精的辅助治疗中均得到了广泛应用。本研究选用中药毓麟珠，通过观察其对卵巢线粒体形态、分布并检测其活力，探索其防治POI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c雌性小鼠7～8周龄40只，每只体重20～25 g，由北京维通利华技术有限公司提供，批号：SCXK 2012-0001。

1.2 实验药物与试剂

阳性对照药：使用去离子水溶解戊酸雌二醇药片(拜耳，德国)，浓度为0.009 mg/mL。

中药毓麟珠制剂：包括当归12 g、熟地12 g、菟丝子12 g、人参6 g、花椒6 g、白术6 g、炒白芍6 g、杜仲6 g、茯苓6 g、鹿角霜6 g、川芎3 g、炙甘草3 g，饮片购自北京同仁堂科技股份有限公司。根据“人与动物体表面积等效剂量比例表”煎煮。确定中药低剂量组每只小鼠按照体重每日给予中药等效剂量0.234 g/mL，0.3 mL/只，高剂量组0.936 g/mL，0.3 mL/只，4℃冰箱保存。

造模试剂：根据小鼠透明带3(ZP3)的330～342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)合成透明带，分析纯度>90%(杭州中肽)，分别与弗氏完全佐剂(F5506，Sigma，美国)混匀成免疫试剂，与弗氏不完全佐剂(F5581，Sigma，美国)混合均匀制成免疫增强剂[5]。

1.3 动物模型建立、分组及给药

通过阴道脱落细胞涂片筛选出性周期正常的雌性小鼠40只。随机选择8只小鼠作为正常组，其余32只用于造模[5]。造模完成后将32只小鼠随机分成模型对照组、阳性对照组、低剂量组和高剂量组四组，每组8只，加上正常组8只，共5组。阴道脱落细胞涂片显示动情周期紊乱提示造模成功，第15天开始灌胃。正常组和模型对照组给予生理盐水0.3 mL，1次/天；阳性对照组每次0.3 mL戊酸雌二醇溶液，1次/天；低剂量和高剂量组给予中药毓麟珠灌胃0.3 mL，1次/天，连续6周(休息1天/周)。

1.4 动物血液采集和卵巢组织收集

给药6周结束后，腹腔注射孕马血清促性腺激素(Solarbio，P9970)10 IU/只促排卵，48小时后用4%多聚甲醛0.1 mL/10g麻醉小鼠后心脏穿刺取血分离取上清，小鼠腹腔V形剪开剥离卵巢组织。卵巢戳破释放卵丘-卵母复合物培养17小时，脱掉颗粒细胞获得卵母细胞。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的测定 将小鼠血清的上清液取出采用氧化应激指标检测试剂盒(南京建成生物公司提供)，按照说明书操作检测。

1.5.2 小鼠卵巢电镜观察线粒体形态 将卵巢切成1×1×1 mm3大小的组织块放入Gluta固定液中4℃固定，电镜样品常规处理，纯包埋剂包埋，超薄切片，厚度120 nm，4%醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜拍照观察。

1.5.3 卵母细胞线粒体荧光染色 将卵母细胞转移到400 nmol/L Mito Tracker Green FM(Invitrogen，M7514)四孔皿中染色，冲洗，加入10 μg/mL Hoechst 33342(罗比，RY-IF010a)核染色。移入激光共聚焦皿中，滴加防荧光淬灭剂，供激光共聚焦显微镜观察分析。

1.5.4 卵母细胞线粒体膜电位测量 将卵母细胞转移到10 μg/mL JC-1(Biovision，catalog number 1130)四孔皿中染色。观察红色荧光激发光、发射光波长为559 nm、572 nm，绿色荧光激发光、发射光波长488 nm、520 nm，测得荧光强度，取红光/绿光的比值代表膜电位(ΔΨm)。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 毓麟珠对免疫性POI小鼠阴道分泌物的影响

阴道涂片观察显示，正常组小鼠动情周期正常，其余四组发生紊乱，表明造模成功。给药结束后，阳性对照药组、低剂量组、高剂量组动情周期基本恢复规律。肉眼观察可见上述三组小鼠阴道分泌物黏稠呈拉丝状，阳性对照组分泌物较为稀薄。镜下观察，正常组小鼠动情期细胞均质，角化上皮细胞呈落叶状堆积；模型对照组动情期细胞不均质，有多种细胞混杂；阳性对照组、低剂量组和高剂量组细胞均质，其中高剂量组角化上皮细胞数量最接近正常组(图1)。

注：A：正常组；B：模型对照组；C：阳性对照组；D：低剂量组；E：高剂量组。

2.2 毓麟珠对免疫性POI小鼠血清ROS、SOD、MDA、GSH-Px表达水平的影响

氧化应激指标结果显示，与正常组比较，模型对照组ROS上升，GSH-Px下降(P<0.01)，MDA有上升，SOD有下降趋势，表明POI疾病模型中氧自由基过度增加产生氧化应激反应。与模型对照组比较，阳性对照组、低剂量组及高剂量组ROS下降(P<0.01)，MDA均有下降趋势，SOD均有上升趋势，阳性对照组和低剂量组GSH-Px升高(P<0.01)。与阳性对照组比较，低剂量组ROS降低(P<0.01)，高剂量组GSH-Px降低(P<0.01)。与低剂量组比较，高剂量组GSH-Px有显著差异(P<0.01)(表1)。

表1 毓麟珠对免疫性POI小鼠血清ROS、SOD、MDA、GSH-Px表达水平比较

2.3 毓麟珠对免疫性POI小鼠卵母细胞线粒体染色和分布的影响

线粒体荧光染色图片显示，正常组线粒体在胞质里分布均布，荧光强度均匀；模型对照组线粒体在近卵母细胞膜的地方较少，荧光强度较弱；阳性对照组、低剂量组、高剂量组线粒体荧光强度增加，与阳性对照组相比在胞质跟膜的分布上，高剂量组效果较好，且比低剂量分布更均匀(图2)。

图2 免疫性POI小鼠血清线粒体荧光染色图

2.4 毓麟珠对免疫性POI小鼠卵母细胞线粒体形态的影响

与正常组比较，电镜观察到模型对照组线粒体平均体积增大，比表面积减小，密度减低，数目减少，部分线粒体之间融合，且出现病变如肿胀，空泡样变及包涵体形成，有白泡样变且有出现高尔基体肿胀，内质网肿大等。正常组的线粒体基本呈圆形，分布密度适中，内嵴清晰分明。阳性对照组线粒体形态基本呈圆形，嵴少见，轮廓明显。低剂量组出现不少线粒体和小泡，并有少量的脂滴，线粒体嵴不明显，基质密度不均匀，局部空化。高剂量组线粒体嵴明显，基质密度均匀，数量较多，少量线粒体局部空化(图3)。

注：A：正常组；B：模型对照组；C：阳性对照组；D：低剂量组；E：高剂量组。

2.5 毓麟珠对免疫性POI小鼠卵母细胞线粒体膜电位的影响

与正常组比较，模型对照组膜电位显著下降且有统计学差异(P<0.01)。与模型对照组比较，阳性对照组、低剂量组和高剂量组显著升高且有统计学差异(P<0.01)，且高剂量组的膜电位比低剂量组高且有比阳性对照组高的趋势，膜电位值最接近正常组(图4、表2)。

表2 毓麟珠对免疫性POI小鼠卵母细胞线粒体膜电位的影响

3 讨论

女性生殖功能直接由卵巢的寿命决定，由大约30万个原始卵泡组成，发挥生殖细胞库的作用[6]。尽管ROS在排卵过程中起着重要作用，但ROS介导的氧化应激对女性生殖有着不利作用，特别是对卵巢功能和一些生殖疾病。优质卵子的发生，生殖细胞的生长、发育和分化都需要充足的ATP水平。由核苷酸改变引起的线粒体功能障碍可能导致卵子发生受损或加速生殖细胞凋亡和POI。ROS可触发线粒体通透性转换孔在单个线粒体内的诱导，进一步刺激ROS形成，线粒体通透性转换孔开放是线粒体对氧化应激的一种反应，导致ROS信号放大，大量的ROS导致钙离子从内质网释放，钙离子内稳态受损，线粒体通透性改变，ATP合成停止，线粒体膜电位不稳定，导致卵母细胞老化[7]。

毓麟珠出自《景岳全书·妇人规》，由八珍丸加菟丝子、杜仲、鹿角霜、川椒等12味药物组成。全方益气养血，温补脾肾，调经种子。现代临床常将其作为补肾育卵助孕之方。方中主要药物熟地、当归、人参。熟地补益精血，可通过兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致促肾上腺皮质激素的释放增加，抵抗血清雌激素水平下降，减缓卵巢衰老[8]。当归补血和血，可以加速血液的生成与流通，同时还能保护和改善造血微环境[9]。人参大补元气，补脾益肺，有改善造血机能提高机体免疫力的作用[10]。通过上述中药药理活性的研究表明该方具有抗氧化应激及抗衰老的作用。

本研究发现，给药组氧化应激水平改善表现在ROS下降、GSH-Px上升，其中中药组表现了更加明显的优势。研究表明，排卵前卵泡调节ROS的生成是卵子发生的重要促进因子[11]。氧限制或缺氧可刺激卵泡血管生成，对卵泡的生长发育影响重大，氧自由基可作用信号转换器或细胞内信使引发血管生成反应，卵泡内血管生成的损害可以导致卵泡闭锁[12]。因此,表明中药在降低氧自由基过度产生、增加抗氧化因子，缓解氧化应激上更有优势。本实验通过线粒体荧光染色图片和电镜显示，毓麟珠高剂量组线粒体的荧光强度、分布和形态、数量都有较好的改善，膜电位水平大幅提高，说明中药组在提升线粒体活性上有显著作用，且高剂量组线粒体的活力水平恢复接近正常。相关研究表明，低质量的卵母细胞线粒体膜电位降低，DNA损伤增加，形态异常，基因表达改变，这些线粒体变化产生了过量的活性氧[13]。由此可以推断，毓麟珠可能通过干预免疫性POI小鼠卵母细胞线粒体的荧光强度、分布和形态、数量以及活力水平，改善激素水平和氧化应激反应，进而改善卵子质量帮助改善卵巢功能。但是对毓麟珠的有效成分及其作用靶点还需进一步深入研究，相信从卵母细胞线粒体入手，更全面的实验探索将会对卵巢功能下降相关疾病的治疗提供更多的依据，为POI妇女实施更优化的助孕策略提供帮助。

图4 免疫性POI小鼠线粒体膜电位荧光图