淫羊藿苷对去势雌性高血压大鼠内皮祖细胞的类雌激素保护作用研究

孟园 李平 赵超群 袁晶 李青穆 赵静苗 刘欣

高血压时，RAAS系统及交感神经系统的激活，高同型半胱氨酸及高血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)等状态使血管收缩和舒张的平衡被打破，且能够导致血管内皮功能受损。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮前体细胞，可以分化为成熟的血管内皮细胞，对受损血管内皮具有修复作用。研究表明，高血压患者EPCs数量明显下降[1]，且EPCs的迁移能力明显降低[2]，从而影响了EPCs对受损内皮的修复。内皮功能障碍与高血压的发生相互影响、互为因果[3]、恶性循环。因此，增加EPCs数量，改善其功能成为抗高血压的又一途径。众多临床试验[4-6]及基础实验[7-8]皆证明雌激素对于EPCs起到保护作用，雌激素可抑制外周血EPCs衰老和凋亡，增加其数量，并增强其增殖、分化及迁移等生物活性。雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy，ERT)现应用于心血管疾病临床防治，但存在争议。中药淫羊藿具有补肝肾，助阳益精，祛风湿，治阳痿，腰膝痿弱、风湿痹痛等功用。淫羊藿具有类性激素作用，且临床上二仙汤(仙茅、淫羊藿是其重要组成)常用于治疗围绝经期及绝经后女性高血压，疗效显著[9-10]。淫羊藿苷为淫羊藿的主要药用成分，除改善性功能障碍、更年期骨质疏松、老年痴呆、风湿性关节炎等疾病外，还具有心血管保护方面作用，能够抗动脉粥样硬化[11]，抗高血压[12]，抗心肌缺血再灌注损伤[13]等。有研究[14]报道，淫羊藿苷是一种植物类雌激素。淫羊藿苷的抗高血压作用是否与其类雌激素作用有关，且淫羊藿苷的降血压作用是否通过调节EPCs实现的。为此，本课题通过给予去势雌性自发高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)外源性雌激素及淫羊藿苷干预，观察淫羊藿苷对高血压EPCs增殖及功能影响，并探索其作用机制，为淫羊藿降作用提供新角度的阐释。为植物类雌激素应用于心血管疾病的防治提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

9周龄清洁级去势雌性SHR大鼠50只，体重(150±10)g。9周龄清洁级具有相同遗传背景的正常血压的雌性京都Wistar大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)10只，体重(150±10)g。以上动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号：SCXK(京)2016-0006]。普通饲料喂养，室温保持在(22±2)°C，相对湿度(55±5)%，光照时间7:00～19:00。

1.2 实验药物

雌二醇(estradiol，E2)：戊酸雌二醇片(补佳乐)，购自德国拜耳医药保健有限公司出品，批号：200A5; 雌激素受体抑制剂：氟维斯群注射液(芙仕得)，购自国药集团医药控股北京华鸿有限公司，批号：LK774；淫羊藿苷(icariin)：98%纯度标准品，南京广润生物制品有限公司出品，批号：GR-133-150509。

1.3 实验仪器

大鼠尾套管法无创血压计：日本Softron公司，型号：BP-2006A；酶标仪：美国Thermo公司，型号B004；倒置荧光显微镜：日本Olympus公司，型号LX7。

1.4 实验试剂

大鼠骨髓EPCs分离液试剂盒：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：VE2012TARK(G)；大鼠外周血EPCs分离液试剂盒：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：VE2012RATK；EPCs培养基：Lonza公司，EGM-2 BulletKit，货号：CC-3162(CC-3156&CC-4176)；一氧化氮(nitric oxide,NO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，货号：A012-1-2；FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)，Sigma公司，货号：L9006；Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)：索莱宝公司，货号：H7970；纤维蛋白(fibronectin，Fn)：Corning公司，货号：356008。

1.5 实验造模

10只WKY、50只SHR雌性大鼠给予普通饲料适应性喂养1周，继而行无菌卵巢切除术，按1 mL/100 g ，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹位固定，于躯干下1/3，脊柱两侧各1 cm处延脊柱方向作纵形切口，长约1 cm，逐层分离，深入体腔，可见肉色卵巢团块，用眼科镊轻轻将其拉出，下联直径约0.1 cm的肉色输卵管，在输卵管近卵巢端穿一丝线，结扎，减去卵巢及余线，将组织退回腹腔，缝合切口，给予切口青链霉素预防感染。

1.6 分组及给药方法

术后14天后，10只WKY雌性大鼠作为空白组(WKY组)。将SHR雌性大鼠随机分为模型组(SHR组)、雌激素组(SHR-E2组)、淫羊藿低剂量组(SHR-I组)、淫羊藿高剂量组(SHR-HI组)及淫羊藿苷低剂量组+氟维司群组(SHR-I+ICI)。由于预实验表明淫羊藿低剂量组20 mg/kg保护效应较淫羊藿高剂量组40 mg/kg略强，因此此处设置低剂量组+雌激素受体拮抗剂。每组各10只大鼠。WKY组、SHR组给予溶剂纯水灌胃，SHR-E2组给予戊酸雌二醇灌胃，SHR-I组、SHR-HI组分别给予低、高剂量的淫羊藿苷灌胃，SHR-I+ICI组按每月52 mg/kg给予皮下注射氟维司群注射剂。

1.7 大鼠外周血及骨髓来源EPCs分离及培养

给药8周后，各组大鼠全部给予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉抽取大鼠外周血5～10 mL，缓慢加于盛有EPCs分离液的离心管中，注意外周血在上，分离液在下，外周血：分离液体积1∶2，且二者须保持明显界限，离心500 g，25分钟。离心后，吸取中间云雾层，并用清洗液洗涤细胞两次后，培养基重悬进行计数及培养(具体步骤参见大鼠外周血EPCs分离液试剂盒)。

大鼠失血性死亡后，剪开皮肤，暴露并剪取后肢，置于75%酒精中浸泡15分钟，转至超净台操作。在超净台上剪开两端骨骺，暴露骨髓腔并用冲洗液冲洗至骨干发白。收集冲洗液并吹打均匀后，经细胞筛过滤，制成细胞悬液，离心450 g， 5分钟后弃上清。用稀释液重悬细胞，缓慢加于盛有EPCs分离液的离心管中，注意细胞悬液在上，分离液在下，细胞悬液与分离液的体积比为1∶2，且二者须保持明显界限，离心500 g，25分钟。离心后，吸取中间云雾层，并用清洗液洗涤细胞两次后，培养基重悬进行计数及培养(具体步骤参见大鼠骨髓EPCs分离液试剂盒)。

将每组4只大鼠的外周血和骨髓来源的EPCs悬液以每孔2×105的密度接种在事先包被好纤维蛋白的12孔板内，每3天换液一次，于种植后1天、3天、6天于倒置相差显微镜下观察细胞形态，并于第4天给予细胞鉴定。其余6只大鼠的外周血和骨髓来源的EPCs悬液以每孔2×104的密度接种在96孔板内培养，每组设6个复孔，培养4天后进行细胞活性及NO分泌水平测定。

1.8 指标检测

1.8.1 各组大鼠体重检测 自动物饲养之日起每周电子称监测大鼠体重。

1.8.2 各组大鼠血压及心率比较及自身用药前后比较 每组随机选取5只大鼠，选择大鼠去势后药物干预之前，以及药物干预8周后两个时间点测量平均动脉压及心率。测量方法：用日本Softron公司生产的动物无创血压计BP-2006A，将套管套在大鼠尾部，加热鼠笼，使大鼠在温暖的环境中逐渐平静，待情绪稳定后测量大鼠静息状态下的血压。

1.8.3 EPCs鉴定 提取外周血及骨髓来源的EPCs，用FITC-UEA-I与Dil-Ac-LDL对贴壁细胞进行荧光染色进行细胞鉴定。

1.8.4 四噻唑蓝(MTT)法检测各组大鼠外周血及骨髓来源EPCs活性 将各组骨髓及外周血来源的EPCs以2×104接种在事先包被好Fn的96孔细胞培养板上，4天后，避光条件下每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37℃、5%CO2条件下孵育4小时；弃上清，每孔加入150 μL DMSO；震荡摇匀10分钟；用酶标仪(测定波长490 nm)测定吸光度值。

1.8.5 NO分泌水平检测 硝酸还原酶法检测各组外周血及骨髓EPCs培养上清液中NO分泌水平，操作按南京建成试剂盒说明书步骤进行。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠体重变化

给药前WKY及SHR各组大鼠体重无差异(P>0.05)。给药后，雌激素能够明显降低雌性SHR组大鼠体重(P<0.05)，而淫羊藿苷对大鼠体重无明显影响(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠给药前后体重变化比较

2.2 各组大鼠给药前后平均动脉压差异

给药前，SHR组大鼠平均动脉压与WKY组雌性大鼠比明显升高(P<0.05)，而SHR各组间无明显差异(P>0.05)。给药后，WKY组及SHR组大鼠明显升高(P<0.05)；SHR组大鼠与WKY雌性大鼠比明显升高(P<0.05)，雌激素及淫羊藿苷能够明显降低SHR组大鼠平均动脉压(P<0.05)，且淫羊藿苷的降血压作用能够被雌激素受体抑制剂削弱(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠给药前后平均动脉压变化比较

2.3 各组大鼠给药前后心率差异

给药8周后WKY组及SHR组大鼠心率较自身之前明显升高(P<0.05)。给药前，WKY及SHR各组间大鼠心率无差异(P>0.05)。给药后，雌激素对SHR组大鼠心率无影响(P>0.05)，淫羊藿苷能够明显降低SHR组大鼠心率(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠给药前后心率变化比较次/分)

2.4 各组大鼠外周血及骨髓来源EPCs培养及鉴定

2.4.1 EPCs形态学特征 倒置相差显微镜下，刚分离得到的EPCs呈圆形，培养1天后可见细胞贴壁，见图1A、图1D；细胞呈梭型，菱型或三角型。培养72小时后，可见细胞体积较之前增大，并且可以看见散在的呈梭形的贴壁细胞，见图1B。培养6天后，细胞呈梭形或排列成索条状，增殖较前缓慢，见图1C。

注：A：培养1天(4×10)；B：培养3天(4×10)；C：培养6天(4×10)；D：培养1天(10×10)。

2.4.2 EPCs鉴定 贴壁细胞经过Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色后，在倒置荧光显微镜下检查，可见到吞噬Dil-ac-LDL的细胞呈现红色荧光，见图2A；吞噬FITC-UEA-1的细胞呈现绿色荧光，见图2B；双染色阳性的细胞便是分化中的EPCs，见图2C。

注：A：吞噬Dil-ac-LDL；B：吞噬FITC-UEA-1；C：双染。

2.5 各组大鼠外周血及骨髓来源EPCs活性差异

与WKY雌性大鼠相比，SHR组大鼠骨髓及外周血来源EPCs活性皆明显降低(P<0.05)。雌激素及淫羊藿苷能够明显增加SHR组大鼠骨髓及外周血来源EPCs活性(P<0.05)，且淫羊藿苷的作用能够被雌激素受体阻断剂削弱(P<0.05)。结果见表4。

表4 各组大鼠骨髓及外周血来源EPCs活性的OD值比较

2.6 各组大鼠外周血及骨髓来源EPCs培养上清液中NO分泌水平

与WKY雌性大鼠相比，SHR组大鼠骨髓及外周血来源EPCs培养上清液中NO分泌水平皆明显降低(P<0.05)。雌激素及淫羊藿苷能够明显增加SHR组大鼠骨髓及外周血来源EPCsNO分泌水平(P<0.05)，且淫羊藿苷的作用能够被雌激素受体阻断剂削弱(P<0.05)。结果见表5。

表5 各组大鼠骨髓及外周血来源内皮祖细胞NO的分泌水平比较

3 讨论

血管内皮功能损伤是心血管疾病重要病理生理基础和始动环节。内皮损伤后可通过细胞自噬限制损伤扩大，且骨髓来源的EPCs能迁移至内皮损伤部位，合并入内皮细胞层，分化为成熟的内皮细胞，进而修复损伤。因此，EPCs的功能对于内皮损伤修复至关重要。但研究表明，高血压患者由于其高AngII水平及高Hcy水平， EPCs 数量明显下降[15]，EPCs的迁移能力明显降低[2]。本研究结果表明，与WKY大鼠相比，SHR大鼠EPCs活性及NO分泌能力明显降低，印证上述临床现象，并与其他实验研究结果相一致[16]。

雌激素替代治疗中发现，雌激素能够抗高血压[17-18]。绝经前女性外周血中EPCs的水平明显高于同龄男性，进入绝经期后，女性外周血中的EPCs水平下降，与同龄男性外周血中EPCs水平基本相同[4]，可见高血压的性别差异与EPCs功能有关，雌激素对于EPCs的保护作用在此起了关键作用。应用雌激素替代治疗的患者较未用雌激素替代治疗的患者外周血中EPCs数目有所增加[6]。且动物实验表明雌激素能够动员骨髓EPCs，增加外周血中EPCs的数目[8,19]，增强EPCs增殖，分化及迁移等生物活性，且这一作用是通过激活ERα，并通过下游PI3K通路来实现的[20-21]。雌激素能够通过膜雌激素受体激活PI3K/Akt/eNOS信号途径抑制EPCs的凋亡，促进其增殖，增加NO的生成[22]。本研究证实，外源性雌激素能够降低SHR大鼠血压，且与其增加骨髓及外周血中EPCs活性及NO分泌能力，这一作用可能是通过膜雌激素受体实现的。本研究结果与以上研究结果相一致。

雌激素对于女性心血管的保护作用明确，心血管疾病的雌激素替代治疗也是目前研究的热点，但其不良反应、给药剂型、用药时机等仍存在争议。中医补肾法中药汤剂及众多植物类雌激素对女性心血管疾病治疗有其优势。淫羊藿苷作为淫羊藿的主要药用成分，具有抗高血压作用，且既往研究证实其能够增加血管生成，减少氧化应激损伤下EPCs细胞的自噬[23]，其对人外周血EPCs细胞的保护作用已被多项研究证实[24-26]，但尚无同时探索其对骨髓及外周血二者EPCs影响的研究。且关于淫羊藿苷抗高血压的报道较少。本研究探索了淫羊藿苷的降血压作用，研究结果证实了其有较好的降压效果，不逊于雌激素，效果可达10～20 mmHg，为其后期单用、组方或与西药联合应用于临床降血压治疗提供了理论依据。且本研究首次探索淫羊藿苷对高血压大鼠骨髓及外周血来源的EPCs的保护作用，证实其能够增加EPCs的细胞活性，增加其NO分泌，且该作用可能是通过直接或间接作用于雌激素受体发挥作用的。因此，推测淫羊藿苷对高血压EPCs的保护作用是一种类雌激素作用。

综上所述，本研究发现，淫羊藿苷能够降低大鼠血压、心率，该作用可能与其增加EPCs活性，增加其NO分泌能力有关，且该作用与雌激素相似，其机制可能与其激活雌激素受体下游通路有关。淫羊藿苷作为一种植物类雌激素作用温和，临床应用前景广阔，但其对心血管疾病及血管内皮细胞功能的保护作用及其机制仍需进一步深入研究。