微生物发酵产L-色氨酸的研究进展

王悦鹏,吴 涛

(通辽梅花生物科技有限公司,内蒙古 通辽 028024)

色氨酸又名为α-氨基-β-吲哚丙酸,其分子式为C11H12N2O2,共有3种同分异构体,分别为D-色氨酸、L-色氨酸以及两种异构体的消旋混合物DL-色氨酸[1]。20世纪初期,Hopkins首次从酪蛋白中分离获得色氨酸。色氨酸为白色或微黄色晶体,在碱性条件下可稳定存在[2]。常温下溶于水,微溶于乙醇,不溶于氯仿等有机试剂[3]。L-色氨酸是8种必需氨基酸之一,人和动物只能通过食物来摄取L-色氨酸。D-色氨酸主要存在于植物和微生物之中,动物中含量极少,而且在人体内几乎不发生代谢作用,也无毒性[4]。目前色氨酸广泛应用于食品、饲料、医药以及农林等行业[5]。在食品中添加色氨酸可促进蛋白质吸收[6],作为饲料添加剂使用时可令动物增重[7]。此外,色氨酸可转化为5-羟色胺,促进球蛋白生成,提高机体免疫力[8]。L-色氨酸年产量超过5万吨[9],但仍低于潜在的市场需求量[10]。传统的生产方法主要有化学合成和蛋白质水解[11]。由于生产原料有限、污染问题严重以及成本偏高等原因,上述方法已逐渐被微生物法取代。随着生物技术的不断发展以及微生物法所特有的成本低、环境友好及高密度发酵的优势,涉及微生物生产色氨酸的策略已得到广泛应用和研究[12]。

目前,微生物发酵产色氨酸还存在着合成代谢通路的碳通量较低、色氨酸前体数量不足、以及调控机制复杂等缺陷[13]。笔者综述了国内外利用微生物发酵生产色氨酸的研究现状,介绍了利用代谢工程手段与发酵过程控制的方法提高色氨酸产量的策略,并对未来的研究方向进行展望。

1 L-色氨酸生产菌株的改造

L-色氨酸的主要生产菌株为谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌。谷氨酸棒杆菌是一种工业化发酵生产氨基酸常见的微生物,其安全性强、代谢网络易改造、遗传较为稳定[14]。大肠杆菌也是一种广泛使用的生产宿主,具有良好的遗传背景,在廉价培养基中可快速生长,有效地降低了生产成本。L-色氨酸的生产菌株及研究水平如表1所示。

表1 L-色氨酸的生产菌株及其研究水平

1.1 菌种筛选及诱变育种

早期的菌种筛选大多是通过诱变育种的方法得到竞争途径缺失或反馈调控缺陷的色氨酸高产菌。1993年,Azuma等[15]通过重复随机突变筛选出了一株能高产色氨酸的菌种,在发酵过程中流加葡萄糖与前体物邻氨基苯甲酸,色氨酸产量为54.5 g/L。陈立平[16]利用紫外线与硫酸二乙酯联合诱变大肠杆菌后,优化了培养基配方及发酵条件,产酸可达55.1 g/L。许多随机诱变菌株均有较高的产酸,具有大规模生产的可能,但突变很可能在菌株基因组的其他位置发生,不仅在筛选上较为费力,还影响菌株的进一步改良。

1.2 菌株的代谢工程改造

利用基因工程手段改造色氨酸的代谢途径已成为提升色氨酸产量的重要研究方向。以大肠杆菌为例,3种芳香族氨基酸的合成都始于磷酸烯醇式丙酮酸与4-磷酸赤藓糖的缩合,二者在DAHP合酶的催化作用下,生成3-脱氧阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DHAP)。DAHP合酶是关键限速酶,将中心代谢的碳流量导入芳香族氨基酸合成途径。该酶由3种同功酶组成,其中AroG贡献80%酶活力、AroF贡献15%，AroH仅占5%,三者分别受芳香族氨基酸的反馈抑制[17]。DAHP经过3步反应生成莽草酸,莽草酸又经过3步反应生成分支酸,一部分分支酸在变位酶的催化下可生成酪氨酸和苯丙氨酸的合成前体-预苯酸。在氨基苯甲酸合酶的催化下分支酸生成邻氨基苯甲酸,最终转化为色氨酸。预苯酸又可以产生两个分支:在预苯酸脱氢酶作用下生成对羟基苯丙酮酸,再生成酪氨酸;另一部分预苯酸则在预苯酸脱水酶催化下生成苯丙酮酸,进一步生成苯丙氨酸。氨基苯甲酸合酶也是色氨酸生成途径上重要的限速酶,该酶由trpED基因共同编码,其活性受到产物色氨酸的反馈抑制[18]。编码分支酸生成色氨酸这一过程5种酶的基因组成了色氨酸操纵子,其中TrpR蛋白调控着色氨酸操纵子的转录翻译,当色氨酸含量达到阈值时,色氨酸激活阻遏蛋白TrpR,阻遏操纵子转录[19]。此外,色氨酸操纵子的转录还受到位于结构基因上游衰减子TrpL的调控。当细胞内色氨酸过量时,衰减子二级结构发生变化,色氨酸操纵子转录终止[20]。

L-色氨酸生产菌代谢工程改造的研究主要集中在5个方面:1) 切断支路及色氨酸分解代谢;2) 调控关键酶的表达;3) 增强中心代谢途径;4) 改造色氨酸转运系统;5) 阻断副产物代谢途径。

1.2.1 切断支路及色氨酸分解代谢

发酵产色氨酸的过程受到诸多因素调节,产生色氨酸的同时也伴随着其他芳香族氨基酸的合成。色氨酸的过量累积会激活下游的分解途径,导致菌体产酸较低。切断芳香族氨基酸支路代谢可以促进更多分支酸转化为色氨酸,同时也可解除对DHAP合酶的反馈抑制。有学者阻断酪氨酸与苯丙氨酸的合成通路后,菌体生长受到抑制[21]。随着基因编辑技术的不断革新,利用基因编辑修饰的遗传编码生物传感器有助于筛选氨基酸高产突变体[22]。有学者在酪氨酸与苯丙氨酸合成途径上构建了调控元件基因,通过在培养基中添加诱导剂调控芳香族氨基酸的合成[23]。此外,色氨酸在色氨酸酶的催化作用下可分解为吲哚、氨与丙酮酸,通过敲除编码色氨酸酶的基因tnaA可避免色氨酸降解[24]。

1.2.2 调控关键酶的表达

除切断支路代谢外,调控关键酶的表达也可提高色氨酸产量。色氨酸合成途径的关键酶DAHP合酶受到3种芳香族氨基酸的反馈抑制,减弱反馈抑制有利于色氨酸的生成。有学者提出了一种将CRISPR/Cas9基因编辑技术与生物传感器引导的体内筛选(CGSS)相结合的方法,用于蛋白质工程和途径优化以筛选抗反馈调节的DAHP合酶,在补料发酵中色氨酸产量增加38.5%[25]。色氨酸操纵子上的结构基因trpE也受到色氨酸的反馈调节,解除色氨酸的反馈抑制可显著提高色氨酸产量及糖酸转化率[26]。还有学者对色氨酸合酶进行分子修饰,突变其关键氨基酸残基,促进了色氨酸生成[27]。磷酸甘油酸脱氢酶(由serA基因编码)参与丝氨酸的合成,丝氨酸对于色氨酸生产至关重要,将解除反馈抑制的serA插入到DAHP合酶基因座中,经补料发酵可获得40 g/L色氨酸[28]。多功能酶TrpC受到邻氨基苯甲酸非竞争性地前馈抑制,突变TrpC上邻氨基苯甲酸的结合位点可使色氨酸产量大幅提升[29]。蔡霞等[30]将DAHP合酶、氨基苯甲酸合酶、色氨酸合成酶共表达,色氨酸产量提高了178.6%。

此外,TyrR和TrpR调控着色氨酸生物合成与转运基因的转录。TyrR属于全局调控蛋白,涉及到色氨酸代谢途径中多个酶的转录,其中包括对于DAHP合酶的转录阻遏[31]。为解除转录阻遏作用,通常敲除TyrR和TrpR编码基因,实现色氨酸产量的提升[32]。

1.2.3 增强中心代谢途径

在中心代谢途径中,磷酸烯醇式丙酮酸与4-磷酸赤藓糖决定了色氨酸生物合成前体的水平。改造中心代谢途径,是提高色氨酸合成途径碳通量的重要手段之一。葡萄糖经过磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS系统)进入糖酵解途径中,为菌体提供ATP与还原力[33],但转运葡萄糖的过程中消耗了大量的磷酸烯醇式丙酮酸,影响了色氨酸积累。有学者尝试用其他转运系统代替PTS系统以增加磷酸烯醇式丙酮酸,但菌体生长受到抑制[3,34]。Flores等[35]敲除PTS系统后筛选到了生长未受影响的突变株,实现了碳通量的重新定向。此外,还可以调节磷酸烯醇式丙酮酸到中心代谢途径的碳通量以促进色氨酸生成。在糖酵解途径中,磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化作用下生成丙酮酸,进入TCA循环;在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化下生成草酰乙酸[36]。在糖异生途径中,丙酮酸又可在磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的催化下实现磷酸烯醇式丙酮酸再生。Yi等[37]敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶并过表达磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因,增加了莽草酸途径碳通量,菌株产酸明显提高。Meza等[38]通过阻断PTS系统与丙酮酸激酶实现了中心碳流量的重新定向。还有学者失活贮碳调节因子CsrA或过表达负调控蛋白CsrB以增加磷酸烯醇式丙酮酸[39]。

4-磷酸赤藓糖是戊糖磷酸途径的中间产物,由7-磷酸景天庚酮糖和3-磷酸甘油醛在转醛酶的催化下生成。研究人员通过过表达转醛酶(talB)和转酮酶(tktA)以提高胞内4-磷酸赤藓糖的浓度[40-41]。Shen等[42]过表达磷酸烯醇式丙酮酸合成酶与转酮酶,又阻断了菌株内色氨酸分解代谢途径并解除色氨酸生成的转录阻遏,最终产酸可达40.2 g/L。路丽君[43]过表达了CsrB与转酮酶来调节碳通量,产酸提高了15.7%。Ikeda[44]通过共表达转酮酶基因与色氨酸合成关键酶基因,色氨酸产量达到58 g/L,是目前谷氨酸棒杆菌的最佳产酸水平。

传统的基因敲除主要采用Red同源重组的技术,随着CRISPR技术的不断革新,越来越多地应用于在氨基酸菌株开发中[45]。有学者利用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌W3110的中心代谢途径进行了改造,修饰了与磷酸烯醇式丙酮酸代谢的相关基因,以增加前体磷酸烯醇式丙酮酸的供应。与此同时,上调了菌株柠檬酸转运系统和TCA循环,有效地促进了细胞的生长,最终色氨酸产量可达49 g/L[46]。

1.2.4 改造色氨酸转运系统

转运系统的改造主要针对产物排出和底物吸收，避免中间体因排泄受到损失,从而达到提高目标产物产量的目的[47]。细胞内色氨酸的浓度直接影响色氨酸关键酶的活性,大量产物在胞内积累会加剧产物抑制效应,因此色氨酸转运系统的改造对提升菌体产酸尤为重要。在大肠杆菌中有3种渗透酶负责色氨酸的转运:AroP,Mtr和TnaB[48]。AroP为芳香族氨基酸通用的转运蛋白,对苯丙氨酸和酪氨酸有更高的亲和性,而Mtr和TnaB则负责特异性地转运色氨酸[49]。在谷氨酸棒杆菌中,仅有AroP负责芳香族氨基酸的转运。在基因工程菌构建过程中通常将氨基酸渗透酶敲除,以避免色氨酸重新同化[50]。

1.2.5 阻断副产物代谢途径

在发酵过程中,副产物的出现降低了营养物质的利用率,抑制了菌体生长与关键酶活性,导致产酸下降[51],使得后续的产物提取变得困难。由于葡萄糖过量或菌体呼吸受限,引起了溢流代谢,导致大量乙酸生成。Wang等[52]敲除了磷酸转乙酰基酶,菌株在发酵前期生长受限,在发酵结束后,菌体的生物量和色氨酸的产量有所提升,乙酸量仅为野生型的20%。Liu等[53]对磷酸转乙酰基酶进行突变,降低了磷酸转乙酰基酶的底物亲和力与催化能力,最终乙酸下降了35%,补料发酵后产酸达到44 g/L。研究人员通过敲除具有乙酸激酶活性的丙酸激酶编码基因(tdcD)控制乙酸溢流,敲除该基因后,菌株在高糖条件下可保持较好地生长与产酸,最终色氨酸可达48.8 g/L[54]。谷氨酸也常作为发酵副产物出现,谷氨酸增加导致谷氨酰胺减少,抑制了邻氨基苯甲酸的活性。有学者则通过过表达谷氨酰胺合成酶以降低谷氨酸水平,从而间接地提高色氨酸产量[55]。还有学者在敲除谷氨酸合成酶编码基因后,在培养基中补加1 g/L谷氨酸,使产酸量提高了10.92%[56]。

2 色氨酸发酵工艺的优化

提高微生物发酵产酸能力不仅要从菌体代谢途径改造入手,对下游发酵工艺的优化也尤为重要。通过对菌株发酵过程的调控,使其生成产物的能力增强,提高对底物的利用率,副产物积累量也随之减少。首先是优化发酵培养基,筛选最适宜菌株生长及产物积累的配方;其次是优化发酵条件,通过调控发酵过程,使葡萄糖的利用率升高,副产物减少,以此促进色氨酸进一步积累。

2.1 发酵培养基的优化

在发酵过程中,碳源提供菌体生长繁殖所必需的能量,同时在产物合成阶段提供碳骨架。适宜的碳源不仅有利于菌体生长，还可以促进产物生成。张婷婷[57]在发酵培养基中分别添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和淀粉,以葡萄糖为碳源时,菌体生长与产物生成都达到最佳值,当初始葡萄糖为30 g/L时,色氨酸产量最高;而蔗糖和淀粉则无法被菌体利用。

氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类:无机氮源和有机氮源。无机氮源在发酵过程中被菌体迅速利用,同时还可以稳定和调节pH。工业上常用的有机氮源多为廉价的原料,除作为氮源使用外,部分有机氮源还能提供大量的无机盐及生长因子。张婷婷[57]测试了多种氮源对色氨酸发酵的影响,加入6 g/L酵母粉和NH4NO3是菌体生物量与色氨酸合成的最佳条件。黄静等[58]发现酵母粉可促进菌体产酸,但其中的杂质会影响菌体生长及产酸。在培养基中加入2 g/L氨基酸粉和0.5 g/L氯化胆碱可以缓解因短暂的氮源缺乏所导致的细胞生长停滞[59]。杨梦晨[60]利用响应面优化培养基中氨基酸与核苷酸成分以替代酵母粉,最终色氨酸产量达到40.8 g/L,副产物乙酸也有明显下降。陈胜杰[61]考察了氯化胆碱、棉籽精粉与核苷混合物对发酵的影响,加入20 g/L棉籽精粉后,色氨酸产量明显提高,达到了40.52 g/L。Xu等[62]利用酸水解细胞,使用其替代培养基中的酵母提取物,最终色氨酸产量可达52.3 g/L。

2.2 发酵条件优化

在工业化生产过程中,发酵温度、pH以及溶氧的优化对于产酸的提高也至关重要。微生物发酵过程中,代谢途径上的多种反应均需要酶进行催化,在酶的帮助下完成底物的分解与产物的合成,因此适宜的温度和pH对于菌株的生长与产物的积累都有非常重要的影响。陈立平[16]通过诱变育种筛选到一株高产色氨酸的菌株,利用单因素实验确定了发酵过程中最佳温度、pH、接种量、种龄以及底糖浓度等条件,色氨酸产量提高了12.4%。溶氧控制是发酵过程中影响产酸的关键因素,供氧不足时,菌体呼吸受限,菌体生长受到抑制,此时菌体溢流代谢明显,乙酸、乳酸增加;当供氧过量时,大部分葡萄糖流向了TCA循环,不利于色氨酸的生成[68]。Zhao等[69]根据发酵的不同阶段对pH与溶氧采用分阶段控制,发酵的前20 h将溶氧控制在20%,pH控制在7.0;在发酵进行到20 h以后,将溶氧控制在30%,pH控制在6.5。对色氨酸代谢途径关键酶进行了转录组学分析,发现此种控制手段有利于代谢流流向戊糖磷酸途径及色氨酸生成途径,最终产酸为52.57 g/L,转化率达到20.15%。

补料发酵广泛应用于发酵工艺中,流加限制性底物可促使微生物更好地利用培养基中的营养物质。娄秀平[70]利用正交实验在摇瓶水平优化了发酵培养基与培养条件后,又考察了不同补料方式对发酵的影响。当发酵液中葡萄糖质量浓度低于5 g/L时,将70%的葡萄糖以15 mL/h的速率流加到发酵罐中,后期由于残糖过高,大量葡萄糖转化为乙酸。考虑到乙酸过高的问题,将葡萄糖间歇地流加到发酵罐中,色氨酸产量较恒速补料提高了13.1%,乙酸也明显减少。考虑到溶氧和pH均为影响菌体生长和产酸的重要因素,根据发酵过程中溶氧与pH的波动进行补料,显著提高了色氨酸的产量和菌体生物量,最大产酸可达24.6 g/L。程立坤[71]提出了控制流加糖浓度使菌体的比生长速率低于阈值的补料策略,在发酵过程中控制菌体最大比生长速率小于0.25,最终产酸达到38.8 g/L,转化率为19.9%。刘镇瑜等[72]利用活细胞在线监测仪检测罐内活细胞数量,利用活细胞数计算比生长速率进行补料,产酸提高了9.62%,副产物乙酸明显减少。还有学者提出了稀糖分罐发酵的策略,在发酵中期将发酵液重新分配,一定程度上提升了产酸[73]。

3 展 望

近年来,随着生命科学的蓬勃发展,越来越多新技术的出现给传统发酵工业注入了新鲜血液。笔者认为今后的研究可以从以下4个方面展开:

1) 共培养策略:氨基酸高产菌株在工业上通常为单一培养。最近,代谢工程已经证明：可以设计微生物联合体,使两个菌株之间分工以生产所需的化合物。张震等[74]利用大肠杆菌TRTH和谷氨酸棒杆菌TQ2223进行混合发酵,有效地减少了副产物的积累,提高了色氨酸产量。

2) 新一代工业微生物底盘菌株的开发:色氨酸的主要生产菌株为大肠杆菌与谷氨酸棒杆菌,二者在菌株改造及发酵过程中存在一定的局限性。此外,在培养过程中易被污染,工业生产中会造成严重的经济损失。有研究学者在极端条件下筛选出了一株可以在高pH和高盐条件下快速生长的盐单胞菌,并对其进行改造用于生产苏氨酸[75]。未来，此类菌株可进一步开发以用于色氨酸发酵生产。

3) 利用组学技术对菌株改造:传统的基因敲除、过表达等定向改造策略在实际生产过程中存在一定的局限性。部分代谢通路的改造可能会抑制菌株生长与产物生成。随着组学技术的发展,包括基因组学、转录组学和代谢组学在内的技术应用可以更好地阐释微生物发酵过程中所隐含的信息,同时可以为菌株的优化过程提供更多的理论指导[76]。

4) 发酵与分离耦合:在生物反应发生的同时,利用合适的分离方法及时地将抑制性产物选择性地从反应体系移除。一方面在线分离产物并解除生物反应过程中的产物抑制可以提高反应强度和产率,另一方面则易于实现生产过程的连续性和自动化。可以降低产物分离过程的投资和操作成本,为企业创造更大的经济效益。

4 结 论

氨基酸生产是我国发酵行业的重要支柱产业之一,随着大宗氨基酸如谷氨酸等产品的产量及市场需求量的饱和,小品种氨基酸及衍生物的开发受到了行业内的关注。越来越多的氨基酸产品从餐桌走向医疗保健、美容化妆等领域。目前,微生物发酵法制备色氨酸的研究取得了较大的突破,部分菌株也具备了工业化生产的能力。菌株的代谢工程改造与发酵优化相结合的策略逐步克服了发酵过程中存在的糖酸转化率较低的问题。同时,此类研究的相关方法也可进一步推广到其他品种氨基酸的生产中,为相关的研究提供理论指导。