不同消泡剂对裂殖壶菌生长的影响

张 良,罗 杰,樊 涛,高启平

(通威股份有限公司,四川 成都 610200)

二十二碳六烯酸DHA是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸,具有促进婴幼儿智力和视力发育、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效[1-4]。裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)因其胞内DHA含量高、生长快和易于培养等优点,是工业产DHA的理想菌株之一[5-7]。裂殖壶菌在发酵过程中会产生大量油脂，结合其他多种因素导致泡沫的形成,而泡沫过量将会造成原料浪费[8]，影响菌体正常呼吸代谢[9]及引起杂菌污染[10],因此为保证发酵的正常进行,需要及时控制发酵体系中的泡沫。

目前,发酵工业中常采用添加消泡剂的方法控制泡沫,考虑到消泡剂的热稳定性、安全性、消泡能力、耐酸耐碱能力和成本等因素,常用的消泡剂主要有聚醚类消泡剂、有机硅类消泡剂和新型聚醚改性硅类消泡剂。聚醚类消泡剂属非离子表面活性剂,主要分为聚氧丙烯甘油GP型、聚氧乙烯氧丙烯甘油GPE型和GPES型3类。其中GP型消泡剂以甘油为起始剂,由环氧丙烷或环氧乙烷与环氧丙烷的混合物进行加成聚合而制成,亲水性差,在发泡介质中的溶解度小,抑泡能力强,消泡能力较弱;GPE型聚醚消泡剂是在GP型消泡剂的聚丙二醇链末端再加成环氧乙烷,成为链端亲水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油,亲水性较好,在发泡介质中易铺展,消泡能力较强,但消泡活性维持时间短。GPES型聚醚类消泡剂是在GPE型消泡剂链端用疏水基硬脂酸酯封头,形成两端是疏水链,中间隔有亲水链的嵌段共聚物。这种结构的分子易于平卧状聚集在气液界面,因而表面活性强,消泡效率高。有机硅消泡剂是由硅脂、乳化剂、防水剂和稠化剂等配以适量水经机械乳化而成[11],其主要的消泡活性组分是二甲基硅油,该类型消泡剂涵盖“抑泡”和“破泡”的双重功能,通过降低水溶液、悬浮液等的表面张力,以防止泡沫形成或使原有的泡沫减少,但在较高温度下容易出现破乳、漂油等现象。聚醚改性硅消泡剂通过在聚硅氧烷链段上引入聚醚链端制成聚醚-硅氧烷共聚物[12],兼具聚醚类消泡剂和有机硅消泡剂两种消泡剂的优点,表面张力低,消泡迅速、抑泡时间长、成本低和用量少。消泡剂的添加会部分影响到菌体的正常生长,不同的消泡剂对微生物细胞生长速率,细胞形态和产物合成的影响不同,因此笔者对有机硅类消泡剂、聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)、聚醚消泡剂237-2和聚醚消泡剂237-5这5种消泡剂对裂殖壶菌菌体生长的影响进行探究,以期筛选出适合裂殖壶菌工业发酵的消泡剂。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

菌种:裂殖壶菌Schizochytriumsp.STW3,来源于通威股份有限公司微生物研发项目组实验室。

活化培养基:葡萄糖5 g/L,酵母浸粉1 g/L,蛋白胨1 g/L,海盐15 g/L,琼脂17 g/L,pH 6.0,121 ℃灭菌30 min。

种子培养基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨5 g/L,海盐15 g/L,pH 6.0,121 ℃灭菌30 min。

发酵培养基:葡萄糖90 g/L,玉米浆干粉15 g/L,酵母膏20 g/L,蛋白胨5 g/L,海盐15 g/L,添加无机盐营养液至发酵培养基体积为12 L,pH 6.0,121 ℃灭菌30 min。

1.2 消泡剂种类及添加量

消泡剂添加量均为12 L发酵体积的0.1%,即12 mL,消泡剂种类及添加方式见表1。

表1 消泡剂种类及对应发酵罐

1.3 培养方法

菌种活化:将保藏于-70 ℃的菌种转接至平板中,28 ℃培养2 d。

一级种子培养:用接种环挑取活化的菌种转接至装液量为50 mL/250 mL种子培养基中,28 ℃,200 r/min培养24 h。

二级种子培养:将一级种子接种至装液量为200 mL/1 000 mL种子培养基中,28 ℃,200 r/min培养20 h,用于发酵罐接种。

1.4 发酵罐发酵工艺

按发酵体积12 L的5%作为接种量,将培养好的二级种子液分别通过火焰接种于装液量为60%的20 L发酵罐中。初始pH 6.0,温度28 ℃,前48 h通过控制转速(200～600 r/min)和通气量(0.72～4.0 m3/h)控制溶氧,使其维持在20%以上,在48 h后通过补料、调整通气量和转速联动控制溶氧在10%～20%。

1.5 检测方法

1.5.1 菌体浓度及生物量的测定

OD测定法测定菌体浓度:取1 mL发酵液稀释后检测600 nm波长下的吸光度。

干重测定法测定生物量:取10 mL发酵液,7 000 r/min离心8～10 min,弃上清收集菌体,80 ℃干燥8～16 h至恒重后称量。

1.5.2 葡萄糖含量测定

发酵过程中,取适量发酵液7 000 r/min离心8～10 min,取上清液,稀释至一定浓度后,采用DNS法[13]测定发酵液中的剩余葡萄糖质量浓度。

1.5.3 氨基氮的测定

采用甲醛滴定法[14]测定发酵过程发酵液的氨基氮质量浓度。

1.6 数据分析

每隔8 h取样测定,所有实验均做3次平行,用Origin 2018绘制成图。

2 结果与分析

2.1 24 h菌体形态检查

根据实验室之前研究,裂殖壶菌在发酵前16 h生长缓慢,16～24 h呼吸代谢作用较强,生长较为旺盛,因此对24 h时不同发酵罐的裂殖壶菌在100倍油镜下进行显微镜检,菌体形态如图1所示。通过显微镜对添加不同消泡剂的发酵罐中的裂殖壶菌在24 h时进行形态观察,结果发现有机硅类消泡剂对裂殖壶菌生长基本无影响,菌体细胞形态完整,部分呈现分裂状,结果如图1(a)所示;图1(b)中裂殖壶菌细胞分裂并不显著,说明聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)对裂殖壶菌的生长存在一定程度的抑制作用;图1(c)中裂殖壶菌细胞分裂较明显,说明聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)对裂殖壶菌生长无显著的影响;由图1(d)可知:聚醚消泡剂237-2对裂殖壶菌的生长有较强的抑制作用,菌体生长迟缓,无明显的分离细胞,且观察到细胞壁破裂;而在添加聚醚消泡剂237-5的发酵罐中,24 h时可观察到部分处于分裂期的裂殖壶菌细胞,结果如图1(e)所示,说明虽然其对裂殖壶菌的生长存在抑制作用,但抑制作用比较弱。

图1 不同发酵罐中24 h时裂殖壶菌镜检结果

2.2 发酵过程中参数的测定

为满足裂殖壶菌的生长需求,在发酵过程中需提高搅拌速度,提高发酵罐中的空气量,从溶氧、转速和通气量三者之间的变动来大致判定发酵罐中菌细胞生长与否。对发酵过程中溶氧、温度、pH和转速及通气量的变化进行监测,结果如图2所示。在整个发酵过程中,不同发酵罐中温度变化差异较小,基本控制在28 ℃,但溶氧、转速、通气量和pH在不同发酵罐中表现出了不同程度的变化。1) 各发酵罐转速变化趋势如图2(a)所示,添加有机硅消泡剂罐的转速在前4 h缓慢增加,8 h后迅速增加至460 r/min,随后保持稳定;在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)和添加聚醚消泡剂237-5的两个发酵罐中整个发酵过程中,转速恒定为200 r/min;在添加聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)和添加聚醚消泡剂237-2的两个发酵罐中,转速随发酵时间的延长逐渐增加,直至32 h时达到480 r/min。转速和溶氧成正比,转速增加会增加发酵罐中溶氧,说明裂殖壶菌生长很好,迅速生长消耗氧气。从转速来看:添加有机硅、聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)、聚醚消泡剂237-2这3种消泡剂是发酵罐裂殖壶菌比添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)和聚醚消泡剂237-5更耗氧,生长更好。2) 各发酵罐通气量变化趋势如图2(b)所示,在添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的发酵罐中,通气量从最开始1.0 L逐渐增加12 h时的4.0 L,随后保持稳定;在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)和聚醚消泡剂237-5的2个发酵罐中,通气量前期保持1.0 L恒定,16 h后增加至1.5 L,随后保持稳定;在添加聚醚消泡剂237-2的发酵罐中,通气量恒定为1.0 L。通气量和溶氧成正比,通气量越大发酵罐内溶氧越高,说明裂殖壶菌生长很好,迅速生长，消耗氧气。从通气量看,在添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的发酵罐中,裂殖壶菌生长好于添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚消泡剂237-5和聚醚消泡剂237-2的3个发酵罐。3) 各发酵罐剩余溶氧变化趋势如图2(c)所示,在添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的发酵罐,发酵罐内溶氧从最开始的100%逐渐下降,在16 h时分别下降到16.5%和12.5%,随后基本保持稳定;在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚消泡剂237-5和聚醚消泡剂237-2的3个发酵罐中,发酵罐内溶氧从最开始的100%分别逐渐下降至81.7%,81.5%和81.2%,下降幅度均很小。发酵罐剩余溶氧越低裂殖壶菌耗氧就越高,裂壶菌生长越好耗氧越高。从溶氧看:添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的发酵罐中裂殖壶菌生长的更好。4) 各发酵罐pH变化趋势如图2(d)所示,添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的发酵罐中,pH在16 h前基本维持在6.0左右,在16 h后整体上逐渐升高至8.36,裂殖壶菌细胞合成大量次级代谢产物,且呼吸作用增强,伴随着体系营养物质耗尽,pH升高;在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚消泡剂237-5和聚醚消泡剂237-2的3个发酵罐中,pH基本维持稳定在6.0左右,说明次级代谢产物不多,pH整体不大,3种消泡剂均对裂殖壶菌细胞生长有抑制作用。

图2 不同消泡剂对裂殖壶菌发酵过程中环境参数的影响

2.3 OD600、生物量、残糖及氨基氮的测定

通过生物量、OD600、残糖和氨基氮的变化趋势,可快速判断发酵罐中裂殖壶菌的生长情况,结果如图3所示。总体上,生物量、OD600、残糖和氨基氮在5个发酵罐中变化趋势保持一致,生物量与OD600测定值显著上升,而残糖与氨基氮质量分数均逐渐下降,不同发酵罐的变化程度不同。1) 各发酵罐生物量变化趋势如图3(a)所示。在添加有机硅消泡剂发酵罐中,随着发酵的进行,菌体生长,生物量从发酵初期的2.9 g/L迅速上升至45.28 g/L。在添加聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的发酵罐中,生物量变化趋势与有机硅发酵罐类似,生物量从2.81g/L迅速上升至32 h时的48.93 g/L;在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)的发酵罐中,生物量从2.77 g/L上升到10.27 g/L;在添加聚醚消泡剂237-2的发酵罐中,生物量从初始2.84g/L增长到14.02 g/L;在添加聚醚消泡剂237-5的发酵罐中,生物量从2.87 g/L逐渐增加至15.02 g/L。生物量能直接反应菌体生长情况,生物量越高,菌体大量繁殖，生长越好。从生物量来看,5种消泡剂中有机硅和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)对发酵罐生物量的影响很接近,且远高于其他3种消泡剂。2) 各发酵罐OD600变化趋势如图3(b)所示。添加有机硅消泡剂发酵罐中,OD600从0.98增加至43.31。在添加聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的发酵罐中,随着发酵时间的延长OD600从0.981增加至46.25,与有机硅消泡剂发酵罐变化趋势类似。在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)的发酵罐中,OD600从0.973增加到9.18，增长幅度很小。在添加聚醚消泡剂237-2的发酵罐中,OD600从0.978增加到9.04，同样增幅很小。在添加聚醚消泡剂237-5的发酵罐中,OD600从0.985增加到12.04。OD600能直观反映菌体生长情况,OD600越高裂殖壶菌生长越好。从OD600来看,添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)的OD600远高于聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚消泡剂237-2和聚醚消泡剂237-5 3种消泡剂。3)各发酵罐残糖质量分数变化趋势如图3(c)所示。添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)发酵罐中,由于菌体大量生长会消耗大量糖类,发酵液中的残糖量随发酵时间的延长逐渐降低,从最开始的93 g/L左右降低到5 g/L左右。在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚消泡剂237-2和聚醚消泡剂237-5 3种消泡剂发酵罐中,残糖质量分数变化趋势很接近,降低很少,说明耗糖低,菌体生长受限制。裂殖壶菌在生长过程中会大量消耗葡萄糖,菌种生长越好,发酵液中残糖质量分数越低。从残糖质量分数变化趋势来看,5种消泡剂中,有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)对菌体抑制作用最小,裂殖壶菌能正常生长。4)各发酵罐氨基氮质量分数变化趋势如图3(d)所示。菌体大量生长需要足够的氮源,大量消耗含氮类物质。在添加有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)发酵罐中,发酵液中的氨基氮质量分数随发酵时间的延长逐渐降低,从最开始的5.6 g/L左右降低到0.9 g/L左右。在添加聚醚消泡剂237-2和聚醚消泡剂237-5 2种消泡剂的发酵罐中,氨基氮质量分数也在逐渐减少,从最开始的5.6 g/L左右降低到3.0 g/L左右,降低幅度不大。在添加聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)发酵罐中,全过程氨基氮质量分数基本无变化,维持在6.0 g/L左右。裂殖壶菌正常生长,会消耗发酵液中的氮源,发酵液中氨基氮质量分数就会相应降低。从氨基氮质量分数变化趋势看,有机硅消泡剂和聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)对裂殖壶菌生长影响较小,其能够正常生长,聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚消泡剂237-2和聚醚消泡剂237-5 3种消泡剂均对裂殖壶菌有一定程度上的抑制作用。

图3 不同消泡剂对裂殖壶菌生长的影响

3 结 论

通过对裂殖壶菌发酵过程进行形态镜检、发酵参数和生长参数测定，研究了有机硅消泡剂、聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)、聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)、聚醚消泡剂237-2和聚醚消泡剂237-5等5种不同的消泡剂对裂殖壶菌生长的影响。结果表明:裂殖壶菌在添加有机硅类消泡剂的发酵罐中能正常生长,有机硅类消泡剂对裂殖壶菌生长的毒害作用较低,可用于裂殖壶菌发酵的备选消泡剂;不同聚醚改性硅类消泡剂对裂殖壶菌生长影响不同,聚醚改性硅消泡剂2(D125-GA)对裂殖壶菌生长影响较小,可作为裂殖壶菌发酵生长的消泡剂,而聚醚改性硅消泡剂1(D120-GA)对裂殖壶菌生长有一定抑制作用,暂不推荐使用此消泡剂;聚醚类消泡剂(聚醚消泡剂237-2、聚醚消泡剂237-5)均会抑制裂殖壶菌的生长,所以在裂殖壶菌聚发酵过程中也不推荐添加聚醚类消泡剂。后续可对有机硅类消泡剂和聚醚改性硅消泡剂的使用浓度、对泡沫的消减能力、对裂殖壶菌生物量及DHA积累的影响等方面需展开深入研究,以确定裂殖壶菌发酵生长的最佳消泡剂。