芍药总多糖抑龋作用的体外研究

李贺　李艳　赵今

[摘要]目的：对比不同质量浓度下芍药总多糖对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌生长、产酸及合成水不溶性多糖（water insoluble glucan，WIG）含量的影响。方法：自行提取芍药总多糖，连续稀释法测定芍药总多糖对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌生长的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）与最低杀菌浓度（minimal bactericidalconcentration，MBC）；将芍药总多糖倍比稀释为小于MIC的4个质量浓度组，以脑心浸液液体培养基为空白对照组，加入108CFU/ml的变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌菌悬液，厌氧培养24h及.48h。pH计测定pH值，计算ΔpH值（初始pH～终末pH）。蒽酮法测定WIG含量。结果：①芍药总多糖对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌生长均有抑制作用，其最低抑菌浓度变异链球菌为110.4mg/ml，血链球菌为27.6 mg/ml，黏性放线菌为13.8 mg/ml；②培养48h后，ZXpH值均随芍药总多糖质量浓度的增大而减小。变异链球菌实验组除1/4MIC、1/2MIC组之外，其余各组间的ApH值差异无统计学意义（P>0.05）。血链球菌1/2MIC组同对照组间有统计学意义（P<0.05）。黏性放线菌各组间差异无明显统计学意义（P>0.05）；③培养24h，WIG含量随芍药总多糖质量浓度的增大而减小。变异链球菌1/2MIC组及血链球菌1/4MIC及1/2MI组同对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论：芍药总多糖对浮游状态下的变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌的生长及变异链球菌、血链球菌产糖、产酸有不同程度抑制作用。

[关键词]芍药；总多糖；生长；产酸；防龋

[中图分类号]R781 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）04-0041-04

芍药总多糖是从芍药中提取出的主要活性物质。武新华等报道芍药提取物能够不同程度抑制金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌等的生长，而其对口腔细菌的影响尚不明确。变异链球菌、血链球菌及黏性放线菌均为是口腔常驻菌。变异链球菌是菌斑生物被膜的常见菌，是与龋病发生关系密切的致病菌。血链球菌在牙菌斑生物被膜形成和细菌在牙体硬组织上聚集定植都有着重要作用。黏性放线菌对其他致龋菌进一步的粘附定居有协同作用。这些细菌在龋病形成的过程中发挥着重要作用。本实验选择了以上细菌作为实验菌株，研究芍药总多糖化学组分对浮游状态下变异链球菌、血链球菌及黏性放线菌的生长及产酸、产水不溶性胞外多糖作用的影响，进一步探索评估其防龋效能。

1材料和方法

1.1实验菌株、仪器及菌悬液、试剂制备。

1.1.1实验菌株：变异链球菌ATCC 76100、血链球菌ATCC10556及黏性放线菌ATCC 19246均由口腔生物医学工程教育部重点实验室口腔生物学研究室提供。

1.1.2实验仪器：隔水式电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司，DNP 9162），二氧化碳恒温培养箱（Forma Direct heat c02 Incubator Thermo Fisher Scientific，P.O.Box 649Marietta，OH 45750，USA），电热压力蒸汽灭菌器（YXQ LM SII，上海迅博实业有限公司医疗设备制造厂），低温超速离心机（德国艾本德eppendorf，型号5417C），pH计（北京赛多利斯仪器系统有限公司，Sartorius AG），分光光度计（上海棱光技术有限公司，Spectrumlab 22型），酶联免疫检测仪（Human，德国）。

1.1.3菌悬液制备及试剂配置

1.1.3.1菌悬液：将实验菌株接种于BHI-S琼脂血平板，置厌氧箱中37℃下复苏48h，涂片镜检，随机选取菌株行生化鉴定，确定为单纯培养后于BHI固体培养基接种传代，置37℃下厌氧培养24h。检查菌落生长形态，镜检无污染，接种环挑选单菌落移至BHI液体培养基中同样条件下培养18h增菌；应用分光光度计测定菌悬液浓度，BHI培养液稀释上述培养物，并用比浊仪校正至1.0McFarland（相当于3×10³CFU/ml）。

1.1.3.2蒽酮试剂：称取200mg蒽酮溶解于100ml浓硫酸中，充分搅拌溶解，置于4℃保存。

1.1.3.3芍药总多糖：新疆赤芍（新疆阿勒泰产，经新疆医科大学中医学院鉴定）。

1.2实验方法

1.2.1芍药总多糖对口腔细菌最低抑菌浓度及最低杀菌浓度（MBC）的测定：将提取的芍药总多糖干粉0.552g，过微孔滤膜后（0.22μm），用生理盐水配成浓度为110.4mg/ml的原液。将原液稀释溶于BHI液体培养基中。并倍比稀释为六个浓度梯度，使其最终浓度达到3.45、6.9、13.8、27.6、55.2、110.4mg/ml。将细菌悬液与各组药液倍比稀释（V/V），接种后震荡60s后，置于20%CO₂，36℃下厌氧培养48h。置于暗色、无反光物体表面，肉眼观察无浑浊出现的最低药物浓度为其MIC（最低抑菌浓度）值；若结果不易判断，挑取少量菌液接种于BHI固体培养基上，置于20%CO₂，36℃下厌氧培养48h，观察是否有菌落生长。最低抑菌浓度测定重复3次。选择大于最低抑菌浓度浓度的各孔，混匀培养基，分别取20μl涂于BHI固体培养基，相同条件下培养24h，观察菌落少于5～6个的最低浓度为最低杀菌浓度（MBC）。实验分组，阳性对照组：含1%葡萄糖的BHI菌悬液液体培养基，每组4个平行；阴性对照组：含0.05%洗必泰，每组4个平行；实验组：含6种不同浓度芍药总多糖，每组4个平行。

1.2.2芍药总多糖对口腔三种致龋菌产酸作用影响的测定：用BHI液体培养基将芍药总多糖配成最低抑菌浓度浓度值，另配含5%蔗糖的PBS缓冲液，用酸度计将两者调定初始pH值为7.4，高压灭菌器中0.1MPa、121.5℃高压15min，根据芍药总多糖对上述三种致龋菌的最低抑菌浓度测定结果，将待测药液按倍比稀释法配置成最低抑菌浓度值以下的4个不同浓度的实验组，每组3平行管。菌悬液与药液按1：10（V/V）分别接种3种细菌，10%C02，36℃厌氧箱中培养48h，利用PH计测定其pH值，并计算ApH值（初始pH～终末pH）。空白对照组以空的培养基ApH值。实验包括4个不同浓度的实验组与1个不含药物的空白对照组。实验重复3次。

1.2.3 WIG含量测定：蒽酮法测葡聚糖标准曲线，计算胞外wIG含量。

1.2.4数据分析：使用SPSS19.0统计软件分析，采用单因素方差分析进行分析。若差异用统计学意义，采用单因素方差分析Dunnett t双侧检验进一步比较各实验组间及实验组与对照组问的差异，检验水准α=0.05。

2结果

2.1 MIC测量结果

芍药总多糖对变异链球菌、黏性放线菌、血链球菌均有抑制作用，其最低抑菌浓度分别是变异链球菌为110.4mg/ml，血链球菌为27.6mg/ml，黏性放线菌为13.8 mg/ml。

2.2芍药总多糖对口腔三种致龋菌产酸作用影响的测定

不同质量浓度芍药总多糖△pH值见表1。变异链球菌、血链球菌及黏性放线菌产酸随着芍药总多糖浓度的升高而减少。培育48h，变异链球菌对照组、1/16MIC、1/SMIC的△pH值的差异无统计学意义（P>0.05），1/4MIC、1/2MIC的△pH值的差异有统计学意义（P<0.05），提示1/4MIC、1/2MIC质量浓度的芍药总多糖可较长久抑制变异链球菌产酸。同理1/2MIc质量浓度芍药总多糖可较长时间抑制血链球菌。而芍药总多糖对黏性放线菌产酸能力的影响与对照组相比无统计学差异。

2.3芍药总多糖对致龋菌合成WIG的影响

不同质量浓度芍药总多糖合成WIG的抑制实验结果见表2。可见：1/2MIC及I/4MIC、1/2MIC质量浓度的芍药总多糖分别对变异链球菌，血链球菌产生水不溶性胞外多糖的抑制作用较强（P<0.05）。同时其在实验浓度下对黏性放线菌产糖几乎没有作用。

3讨论

现代口腔生态学观点认为：变异链球菌、黏性放线菌、血链球菌为主要的口腔致龋细菌，龋病的发生是口腔微生态系统失衡的结果。研究表明变异链球菌在恒牙和乳牙龋病的发生和发展过程中都起着重要的作用，是龋病的主要致病菌，并被认为是口腔生物膜中致龋性最强的微生物之一。血链球菌是菌斑生物被膜最初形成过程中较早粘附定植的菌群。黏性放线菌在菌斑生物膜中对变异链球菌粘附聚集牙面有协同作用，协同促进根面菌斑形成及根面龋的发生。本实验选择了3种标准菌株，即变异链球菌、血链球菌及黏性放线菌，以研究药物对浮游状态口腔主要致龋菌的影响。其中血链球菌为口腔菌斑形成的先锋菌，黏性放线菌则可介导多种口腔细菌在菌斑中的集聚，而变异链球菌则是主要致龋菌。这样的菌株选择能够较大程度上反应口腔细菌菌群构成。

近年，天然药物因药理活性强、毒性低、来源丰富等优点，其在龋病防治中的优势日益显著。目前已发现许多天然药物都具有防龋作用。新疆赤芍是新疆芍药和块根芍药的总称，产于新疆阿勒泰地区，为传统的活血化瘀类中药。目前现有文献报道了芍药粗提物可不同程度抑制金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长。但其对口腔主要致龋菌影响研究甚少。本实验提取新疆赤芍中的总多糖，就浮游状态下的上述三种细菌，测定总多糖对其生长、产酸、产糖作用的影响，评估其防龋效能。

本实验结果显示，芍药总多糖对变异链球菌、血链球菌及黏性放线菌的生长均具有较强的抑制作用，对浮游状态下的变异链球菌及血链球菌的产酸、产水不溶性胞外多糖有着较强的抑制作用。因此，可推测芍药总多糖能有效抑制致龋菌的生长和代谢，抑制致龋菌的毒力因子，有一定的抑制致龋菌的效果。

编辑/张惠娟