脱氢/还原酶及其辅酶再生循环的研究进展

杜美妮,许 超,黄 金

(浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014)

由于传统化学工业造成了环境严重污染以及人们对生物基化学品、生物能源和药物安全性需求的增加,化学工业已显现出从石油基到生物基的快速转变趋势。利用微生物细胞或酶的生物催化功能,进行大规模的物质加工与转化生产人类所需的化学品,已成为各国研究者研究与关注的焦点,其关键核心为生物催化技术[1]。在生物催化技术领域的化学品工业化生产过程中,微生物或酶往往需要在一些不利于生理状态的环境胁迫条件中进行高效的生物合成或转化,而这些环境条件往往成为生化反应顺利进行的限制性因素;同时,在进行筛选适应于反应的辅助底物及其最优条件时往往存在一定的盲目性,费时费力;而通过介质工程的手段对生物催化过程进行革新,近年来虽不断取得新进展,但由于溶媒存在的诸如生物相容性和利用度等问题,通常会降低整个生产过程的效率,增加生产成本[2-3]。因此,如何有效地对生物催化剂进行改造,提高它们在恶劣环境中的生产能力已成为生物催化技术应用亟待解决的关键问题。

1 介导双酮基还原的脱氢/还原酶

脱氢/还原酶在辅酶NAD(H)或NADP(H)的存在下进行羰基的立体选择性还原,因其具有高度的区域和立体选择性,常用于生物催化合成在化学、医药和精细化学品等领域有重要应用价值的手性化合物。与典型的脱氢/还原酶不同,另有一类脱氢/还原酶可以同时还原2个酮基,被命名为双酮基还原酶,其还原过程是先形成稳定的单羟基中间体,再连续地形成双手性醇基化合物,该双手性醇基化合物是他汀类药物的重要手性砌块,其中具有2个手性醇砌块的制备和生产技术已成为制约他汀类药物生产成本的瓶颈技术[4]。该手性砌块的化学法制备具有较大的技术挑战性,如何经济高效地合成该手性砌块已成为国内外化学及生物催化合成研究的热点和难点。生物催化技术具备立体选择性和区域选择性高、过程高效、反应温和、环境友好等特点,利用生物催化技术实现该手性砌块2个手性中心的一步法制备,具有重要的应用价值。但迄今为止,很难将已发现的自然界存在的脱氢/还原酶介导的双酮基还原生物催化过程转化为高效的工业化生产过程,其根本原因在于生物催化过程相对于其他工艺路线,如化学合成,并没有显著的经济竞争优势[1],具体表现在:1) 生物的多样性和辅酶产生/利用途径的多样性特点,致使辅酶的利用机制仍无统一性规律可循,进而在催化过程中表现为额外添加辅酶所带来的生产成本上升;2) 环境胁迫条件下菌体或酶进行改造的步伐缓慢,致使生物催化剂介导双酮基还原的生物催化过程在恶劣环境中的生产能力,如反应体系底物浓度和产率等工业化指标,仍远不能与化学合成方法相媲美。

纵观介导双酮基还原的脱氢/还原酶,可分为3类:墨蝶呤还原酶(sepiapterin reductase,SR)、α-乙酰酮基还原酶(Gre2p)、双酮基还原酶(diketoreductase,DKR),而具备生物催化工业化生产潜力和最新研究的焦点在后两种酶,表1列举了介导双酮基还原的脱氢/还原酶Gre2P和DKR的最新研究进展。其中,来自面包酵母Saccharomycescerevisiae的Gre2p可以显著地将二羰基化合物,特别是α-和β-二酮和酮酯,还原成具有高ee的手性醇,但时空产率较低,且该酶是NADPH依赖性酶,再生需要大量的共底物。Gre2P反prelog规则,其往往催化酮基底物得到S型手性醇[5-6]。Peschke等[7]利用微流控技术来实现(R)-选择性醇脱氢酶、(S)-选择性α-乙酰酮基还原酶和酶葡萄糖脱氢酶的级联反应,控制二酮基底物的选择性不对称还原。Muller等[8]通过重组DNA技术将面包酵母中编码Gre2p的基因克隆至大肠中进行重组表达,提高了目标蛋白的表达量,用丁基琼脂糖凝胶纯化后,纯酶催化2,5-己二酮不对称还原制备(2S,5S)-己二醇,时空产率为70 g/(L·d),相较于面包酵母全细胞转化提高了17倍。除此之外,DKR介导的β,δ-二酮酯的立体选择性双酮基还原“一锅法”生物催化工艺也为他汀类侧链的制备提供了简单有效的途径,Wu等[9-10]发现不动杆菌AcinetobacterbaylyiATCC 33305中存在DKR,可不对称催化还原3,5-双羰基-6-苄氧基-己酸乙酯得到手性双醇3R,5S-二羟基-6-苄氧基己酸乙酯,并通过DNA重组技术将其DKR基因在大肠杆菌中过量表达,纯化后得到的纯酶具有高度的立体选择性,产物的对映体过量值ee和非对映体过量值de均达到99.5%以上。以AcinetobacterbaylyiATCC 33305中的DKR为研究对象,Lu等[11]进行高效催化制备他汀类药物的重要中间体手性双醇砌块的催化机理研究,结合结构测定、分子对接和生化分析等方法对DKR转化双酮基底物产手性双醇的过程进行研究,发现在双酮基还原及其逆反应过程中均生成2个单羟基中间产物,证明DKR催化的双羰基还原是两步反应过程。

表1 关于介导双酮基还原的脱氢/还原酶的报道

2 介导羰基立体选择性还原过程的辅酶再生

如何构建微生物细胞内介导脱氢/还原酶进行羰基的立体选择性还原的辅酶再生循环系统,已成为生物催化法制备手性醇类药物砌块过程的核心问题[13-14],针对此问题的研究一般从酶偶联和底物偶联2个方向开展。介导羰基立体选择性还原的辅酶再生循环系统如图1所示。

图1 介导羰基立体选择性还原的辅酶再生循环系统

在图1(a)所示的酶偶联系统中,通过脱氢/还原酶和辅酶NADP(H)在同一个细胞中共同表达,来实现氧化还原反应和辅酶再生的同时进行,而偶联酶用于酶偶联系统中来强化辅酶NADP(H)的再生,常见的偶联酶有葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶和乙醇脱氢酶。Muller等[8]为克服来源于Thermoanaerobactersp.的醇脱氢酶在体内一步法制备双醇手性砌块催化效率过低的问题,即80 mmol/L双酮底物,125 g/L湿菌体,反应2～3 d,产率90%,纯化了来自于面包酵母的Gre2p,在体外条件下通过添加辅酶NADP(H)和偶联酶葡萄糖脱氢酶,过程体积产率可达80 g/(L·d),但20 mmol/L的较低的双酮底物浓度、昂贵的辅酶添加及外源葡萄糖脱氢酶的添加,无疑降低了其工业化应用价值。据报道[15],通过酶促还原叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯来合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯是目前生物催化工业化制备阿托伐他汀手性侧链的主要方法,但该工艺必须额外添加辅酶NADP(H),工业化成本较高。基于此,Wu等[16]构建了同时表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的全细胞生物催化系统,优化后,在35 g/L的底物质量浓度下转化7 h,无需外源添加辅酶,(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的产率高达到120 g/(L·d),对映体过量值ee和非对映体过量值de均大于99.5%,大大提高了制备他汀类侧链的总效率。

在图1(b)所示的底物偶联系统中,单一酶既充当目标反应的催化剂又充当辅酶再生的催化剂。为了有效地合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S)-CHBE,Xu等[17]通过基因组挖掘技术发现了一种来自解脂耶氏酵母的NADPH依赖性羰基还原酶Y1CR2,其在大肠杆菌中过表达,可将3 000 mmol/L 4-氯-3-羰基丁酸乙酯COBE还原为(S)-CHBE,其产率为90%,ee为99%,并通过添加偶联底物山梨糖醇或甘露醇可以实现NADPH的再生,大大降低了(S)-CHBE的生产成本。Tan等[18]也通过基因挖掘技术发现了可不对称还原COBE得到(S)-CHBE的短链脱氢酶SgCR,在水/甲苯双相系统中,使用异丙醇作为NADH再生循环的辅助底物,COBE转化率达到99%,产物ee>99%,(S)-CHBE时空产率达到22.5 g/L/h。醇脱氢酶与经济的底物偶联来再生辅酶在手性醇的不对称合成中起着关键作用,然而,由于酶对异丙醇的耐受性差以及副产物丙酮的不利影响限制了其应用,Yang等[19]通过传统的基因组挖掘技术从嗜麦芽单胞菌中鉴定出1种新的醇脱氢酶基因,该酶显示出较高的异丙醇耐受性,不添加辅酶的情况下,可以在>150 g/L的高底物负载情况下合成结构多样的手性醇。其中,约780 g/L的乙酰乙酸乙酯仅在2.5 h内即可完全转化为(R)-3-羟基丁酸乙酯,ee为99.9%,时空产率为7 488 g/(L·d)。另据报道,在E.Coli中异源表达来源于Acinetobacterbaylyi可原位再生辅酶的重组DKR,该酶显示出双辅酶依赖型(NAD(H)和NADP(H)),且具有NAD(H)偏好性。通过辅酶的外源添加,并借助辅助底物异丙醇的添加来增加辅酶再生循环强度,可进一步提高催化效率[14,20]。有报道指出[21],大肠杆菌细胞可以通过糖酵解途径和膜内嵌葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶同时再生NADH和NADPH,在以葡萄糖为辅助底物时,细胞被认为能够提供足够多的辅酶用于双酮基底物的还原反应。

因此,通过添加偶联辅助底物或加强偶联葡萄糖脱氢酶基因的表达可强化催化效率,但辅酶再生是还原途径与氧化途径偶联的结果,单方面强化还原途径或氧化途径均会打破反应平衡。因此,如何拓展可利用的还原力,强化在环境胁迫条件下双酮基还原酶介导的还原途径,成为提高催化效率的根本性问题。

3 国内外研究现状及发展动态分析

因介导脱氢/还原酶的辅酶的合成涉及数百个体内代谢途径,例如NAD(H)全程参与微生物胞内300多个氧化还原反应[22],并且从理论上来说人们认为微生物经过生长代谢已经积累了足够量的不同类型的辅酶来应用于不对称还原反应[23],例如通过共表达葡萄糖脱氢酶进行偶联反应,加速后,辅酶的TTN即每摩尔NAD(P)H生成产物的量可高达21 600,不需外加任何辅酶即可完成,所以对辅酶再生循环的理性改造往往从3个方面来进行,辅酶再生方案如图2所示。

图2 辅酶再生循环改进方案

1) 辅酶依赖性的改变:如图2(a)所示,即改造或置换脱氢/还原酶的分子,一般是辅酶结合区,即:临近N端的甘氨酸富集区的特定残基,实现共底物依赖性的改变[24];利用不同辅酶依赖性的酶,实现NADH和NADPH甚至是多种辅酶的高效利用,达到高效催化制备他汀类药物的重要中间体手性双醇砌块的目的,但针对此方面的报道却较为鲜见。大部分醛酮还原酶蛋白N端含有高度保守的辅酶结合区域LxxxGxxxPxxGxG,导致醛酮还原酶更偏爱利用NADPH作为共底物[25],而NADPH价格比NADH贵10倍且稳定性比NADH差,所以NADH作为还原酶的共底物更经济。野生型的5β-孕酮还原酶(P5βRs)通过依赖NADPH作为辅酶能够选择性地还原多种底物,例如类固醇和烯酮。Li等[26]通过酶的理性设计技术成功地确定了决定该酶辅酶特异性的2个关键氨基酸残基,R63K和R64H突变使酶能够以NADH作为辅酶,同时将酶的活性提高了13.8倍。迄今为止,所有报道的7β-羟基类固醇脱氢酶都是NADPH依赖性酶,You等[27]基于结构信息和保守序列的比对合理的设计了5个酶突变体,其中突变体G39D使酶的辅酶特异性从NADPH变为NADH,并且酶的活性增强了223倍。

2) 构建共表达系统:如图2(b)所示,即构建串联表达脱氢/还原酶和偶联酶的表达系统或双质粒表达系统,使生物转化过程中辅酶得到高效利用;昂贵的NAD(P)H添加阻碍了还原酶不对称还原1-boc-3-哌啶酮来生产(S)-N-boc-3-羟基哌啶((S)-NBHP),为了原位再生辅酶,Chen[28]等将来自布氏热厌氧菌属的乙醇脱氢酶基因和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因重组到大肠杆菌BL21(DE3)中,以500 mmol/L的底物浓度制备(S)-NBHP(ee>99%),(S)-NBHP的转化率仅在3 h内就达到了96.2%,时空产率约为774 g/(L·d)。Zhou等[29]为解决近平滑假丝酵母中NADH依赖性(R)-羰基还原酶对2-羟基苯乙酮的生物转化反应缓慢且转化产物(R)-1-苯基-1,2-乙二醇收率低的问题,构建了一个共表达(R)-羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的酶偶联系统,以增强大肠杆菌中的NADH循环途径,在最佳条件下(R)-1-苯基-1,2-乙二醇光学纯度达到了99.9%,且产率为99.9%,葡萄糖脱氢酶的引入使(R)-1-苯基-1,2-乙二醇的光学纯度和收率分别提高了23.8%和63.8%,同时使反应时间缩短到原来的一半。通过上述研究发现,构建共表达系统可通过蛋白表达和生物转化优化来平衡羰基还原反应和辅酶再生反应,以达到强化目标反应的目的。

3) 拓展偶联酶利用度:如图2(c)所示,即依据脱氢/还原酶不对称还原顺序催化机理[30],针对单一辅酶提供有限的还原力已成为脱氢/还原酶介导的全细胞生物催化反应的问题,通过拓展可利用的再生辅酶资源可有效提高催化效率。辅酶再生方案的应用价值一般通过TTN来评估,具有工业规模化生产潜力的辅酶再生方案中,TTN应达到104～106[31]。当前,有许多可有效回收NADPH的原位再生系统,包括工程葡萄糖/葡萄糖6-磷酸脱氢酶[32],甲酸脱氢酶[33]和亚磷酸酯脱氢酶[34]。而回收NADP+的系统在工业上受到限制,目前使用最广泛的偶联酶是谷氨酸脱氢酶,但谷氨酸脱氢酶介导的氧化还原反应会生成副产物谷氨酸使产物的分离纯化复杂化,为此还开发了其他再生方案,包括D-乳酸脱氢酶[35]、NADPH氧化酶[36]和漆酶/介质体系[37],但后三者的TTN值很低,因此迫切需要开发新的辅酶再生体系。Antonio等[31]构建了基于谷胱甘肽的NADP+回收体系,该体系需要使用两种协同作用的酶:来自大肠杆菌的谷氧还蛋白和来自啤酒酵母的谷胱甘肽还原酶,该体系通过谷胱甘肽再循环来再生NADP+,TTN超过5×105,具有工业化应用潜力。

4 结 论

由以上研究结果可知针对双酮基还原酶为代表的脱氢/还原酶高效催化相关反应的研究大都集中在酶活性中心的改造和催化工艺优化上。由于生物的多样性和辅酶产生/利用途径的多样性特点,使辅酶的利用机制仍无统一规律可循,大都是在利用辅酶的偏好性方面进行辅酶依赖性的相关研究,进而使研究进展仍未取得令人满意的结果,比如辅酶的额外添加带来的生产成本上升;反应体系底物浓度和产率等指标仍远不能与化学合成方法相媲美;单纯地通过单脱氢酶(偶联酶)基因的表达来增加NAD(P)+或NAD(P)H的供给,往往得不到预想的效果。因此,依据全细胞可催化脱氢/还原过程且能进行辅酶再生的自然规律,针对构建新型辅酶再生循环体系、微生物细胞自身对外界环境的适应和调节能力方面进行研究,揭示双酮基还原酶及其同工酶辅酶依赖性的分子基础和目标产物双手性醇在最大化的情况下双酮基还原酶利用两种辅酶的机制,赋予辅酶再生循环更清晰的生物学意义,揭示环境胁迫条件下蛋白催化结构域的变化规律,阐述环境扰动因子和催化效率的因果关系,对促进人工调控生物制备过程和源自微生物的重要手性药物中间体的生产具有重要的应用价值。