丙酮酸的微生物发酵生产中的菌种筛选与改良

2024-02-29李莹，赵烁，王震

工业微生物 2024年1期

李莹，赵烁，王震

江苏海洋大学，江苏连云港 222001

丙酮酸作为一种多功能有机酸，在化学、医药和食品工业领据占有重要地位。传统的丙酮酸生产方法主要依赖于化学合成途径，这些方法虽然可以实现大规模生产，但往往伴随着能耗高和环境污染严重等问题。在此背景下，利用微生物发酵生产丙酮酸的方法得到了广泛研究。微生物发酵作为一种可再生的生产手段，不仅有助于减轻对化石燃料的依赖，而且还可以显著降低环境污染。广泛应用于工业微生物发酵的模型菌种，如酿酒酵母和大肠杆菌，在丙酮酸生产过程中也展现出了显著的潜力[1]。本研究旨在详细探讨野生菌种在丙酮酸生产过程中的筛选与改良方法。通过分析酿酒酵母和大肠杆菌在丙酮酸生产中的应用潜力，并结合遗传工程和基因编辑技术对其加以改良，以期提升丙酮酸的发酵效率和产量，为相关人员提供参考。

1 丙酮酸概述

1.1 丙酮酸的工业应用和生物合成的重要性

丙酮酸作为一种至关重要的化学中间体，在多个领域得到了广泛应用，包括合成药物、生物塑料和食品添加剂领域。在医药行业，丙酮酸是许多药物合成的关键原料，如抗生素和抗癌药物。同时，丙酮酸也是生物降解塑料聚乳酸（PLA）的前体物质，这类塑料非常环保。在食品工业中，丙酮酸作为食品添加剂，可用于调整食品的酸度并维持食品的稳定性。与传统的化学合成方式相比，生物合成丙酮酸具有低能耗、低污染和可再生等优点。微生物发酵生产丙酮酸不仅符合绿色环保的原则，还能够利用可再生资源，如以糖类为原料，减轻对化石燃料的依赖。

1.2 微生物合成丙酮酸的潜力

利用微生物生产丙酮酸不仅符合可持续发展的要求，还可以充分利用各种可再生资源，例如农业废弃物和糖类原料，减轻对传统化石燃料的依赖。微生物发酵过程中的丙酮酸生产具有碳效率高、副产品少和过程可控等优点，这使其成为了一种高效且经济可行的生产方法。微生物合成丙酮酸的潜力还体现在其可以通过基因工程和代谢工程加以优化。

2 野生菌种中丙酮酸的筛选

2.1 野生菌种筛选的标准和方法

在微生物发酵生产丙酮酸的过程中，采用适当的野生菌种对于提高效率和产量至关重要。野生菌种筛选的主要标准包括菌株的丙酮酸产量、生长速度、原料转化效率和耐受性。第一，在筛选过程中重点寻找能够高效生产丙酮酸的菌种。这涉及对菌株在特定培养条件下产酸能力的评估，包括产酸速率和产酸总量[2]。第二，理想的菌株应该生长速度较快，以确保在工业生产过程中能够迅速达到所需的细胞密度。第三，菌株应能够适应发酵过程中的各种应激条件，如高浓度的丙酮酸、变化的pH 和潜在的抑制副产品。

2.2 酿酒酵母的丙酮酸筛选实例

发酵过程是评估不同酿酒酵母菌株生产丙酮酸能力的关键阶段。针对酿酒酵母的丙酮酸筛选实施以下实验。

菌株：从不同来源筛选酿酒酵母菌株，比如酿酒厂、野生果实等。

培养基：含有一定浓度葡萄糖的液体培养基。

发酵条件：恒温（30 °C），恒定搅拌速度。

发酵时间：72 h。

丙酮酸测定：发酵结束后，使用高效液相色谱（HPLC）测定发酵液中的丙酮酸浓度。

实验数据如表1 所示。

表1 酿酒酵母的丙酮酸筛选实验数据

从上述数据可以看出，不同来源的酿酒酵母菌株在丙酮酸产量上存在显著差异。菌株YS04（工业应用菌株）在发酵过程中的丙酮酸产量最高，特别是在发酵后期，其产量达到了6.2 g/L，表明其具有较高的丙酮酸生产潜力。菌株YS01（传统酿酒厂）在发酵后期丙酮酸产量达到了5.8 g/L，在丙酮酸生产方面也具有较大的潜力。通过对不同菌株的发酵性能进行评估，可以有效筛选出可以高效产丙酮酸的酿酒酵母菌株。

2.3 大肠杆菌的丙酮酸筛选实例

在用大肠杆菌进行丙酮酸生产的筛选过程中，进行耐酸性测试是非常关键的一步[3]。本次实验将着重于分析不同大肠杆菌菌株的耐酸性测试，以筛选酸性环境下能够稳定生产丙酮酸的菌株。实验设置如下：

获取的菌株：Escherichia coli K12 和Escherichia coli B。

培养条件：含有一定浓度葡萄糖的液体培养基。

pH：分别在pH 4.5、5.0 和5.5 的条件下进行耐酸性测试。

测定指标：在不同pH 条件下的生长速率和丙酮酸产量。

测定方法：使用吸光度测量生长速率，使用HPLC 测定丙酮酸产量。

实验结果如表2 所示。

表2 大肠杆菌的丙酮酸筛选实验数据

从上述数据可以看出，Escherichia coli K12 在所有测试的pH 环境下都表现出了较快的生长速率和较高的丙酮酸产量，尤其在pH 为5.5 时，其生产丙酮酸的能力最强，为3.7 g/L。相比之下，Escherichia coli B 在pH 较低，生长较慢且丙酮酸产量较低的条件下，耐酸性相对较差。结果表明，Escherichia coli K12 菌株在生产丙酮酸时具有较好的耐酸性，适合在酸性环境下进行丙酮酸生产。因此，选择Escherichia coli K12 作为发酵生产丙酮酸的菌株会更加有效。

2.4 高通量筛选技术在丙酮酸生产中的应用

高通量筛选实验旨在评估多种菌株的丙酮酸生产能力。实验设置如下：

实验目的：从多种菌株中快速筛选可以高效生产丙酮酸的微生物。

实验样本：包括多个不同来源的大肠杆菌和酿酒酵母菌株。

实验方法：利用自动化微孔板技术进行微生物培养，并通过高效液相色谱（HPLC）分析丙酮酸产量。

参数：监测每个菌株的生长速度和丙酮酸产量。

实验结果如表3 所示。

表3 高通量筛选实验数据

根据上述数据，可以观察到大肠杆菌菌株EC-02 和酿酒酵母菌株SC-03 都表现出了较高的丙酮酸产量和较快的生长速度，这表明它们是生产丙酮酸的理想候选菌株。EC-02 作为工业株，在丙酮酸生产方面优势明显，而SC-03 作为工业酿酒酵母株，其高产量也彰显了其良好的发酵潜力。通过这种高通量筛选实验，研究人员能够快速评估大量菌株的丙酮酸生产能力，并有效筛选出最佳生产菌株。

3 菌种的遗传工程改良

3.1 遗传工程在菌种改良中的作用

遗传工程在微生物菌种改良中可以提高丙酮酸的生产效率和产量。遗传工程技术使研究人员可以精确修改微生物的基因组，从而优化其代谢路径，增强特定代谢产物的产量，提高其对某些环境压力的耐受性。一方面，遗传工程可以用于提高微生物对原料的转化效率。通过修改特定代谢途径，例如增强与丙酮酸生产相关的酶的活性或表达水平，可以提高丙酮酸的合成效率。这种改造不仅提高了丙酮酸的产量，还可以减少原料损耗和生产过程中产生的副产品。另一方面，遗传工程能够增强菌株的耐受性，使其在丙酮酸积累或环境压力（如低pH、高盐度或氧气限制条件）下依然可以保持稳定生长和高效生产。

3.2 酿酒酵母和大肠杆菌的遗传改造策略

在微生物发酵产丙酮酸的过程中，酿酒酵母和大肠杆菌是两种常用的生产菌株。这两种微生物因遗传背景清晰和易于遗传操纵的特性，成为了遗传改造的理想对象，有利于提高丙酮酸的生产效率和产量。对于酿酒酵母的遗传改造策略，主要集中于优化其丙酮酸的生物合成途径。包括增强与丙酮酸代谢直接相关的酶的活性，还可以通过消除代谢途径中与丙酮酸生产竞争的关键酶基因，如敲除产生乙醇或二氧化碳的途径，将更多碳流向丙酮酸的生产。