高致龋性变异链球菌临床分离株的初步筛选

王成龙　刘佼佼　苏东华　储冰峰　李少华　夏伟　罗燕萍　杨继勇　丁红梅　赵强　邓斌　席庆　徐娟　邵宁生

[摘要] 目的 初步筛选高致龋性变异链球菌临床分离株。方法 通过检测41株变异链球菌临床分离株的产酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成细胞外多糖能力，初步筛选出高致龋性变异链球菌临床分离株。结果 不同的变异链球菌临床分离株体外致龋能力不同，其中3株产酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成细胞外多糖能力均较高，提示可能为高致龋性变异链球菌临床分离株，另外3株产酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成细胞外多糖能力均较低，提示可能为低致龋性变异链球菌临床分离株。结论 通过筛选可能获得了高致龋性变异链球菌临床分离株。

[关键词] 变异链球菌； 产酸； 耐酸； 黏附； 细胞外多糖； 筛选

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.006

变异链球菌是人类口腔中的主要致龋菌。研究[1]表明：从高龋患者口腔中分离获得的变异链球菌临床分离株比从无龋健康人口腔中获得的分离株具有更强的致龋能力，更易诱发龋病；也有研究[2]证实，

不同龋指数患者口腔中的变异链球菌的体外致龋能力是不同的，提示不同个体龋易感性的差异可能与口腔中变异链球菌不同毒力株的致龋能力不同有关。从临床上分离鉴定的变异链球菌临床分离株中筛选出具有较高致龋能力的菌株，对于研究龋病的发病机理是非常必要的。在以前的研究[3]中，本课题组从临床上分离鉴定出41株变异链球菌临床分离株，本研究在此基础上，通过检测变异链球菌临床分离株的黏附能力、合成细胞外多糖的能力、产酸能力和耐酸能力，对变异链球菌临床分离株的致龋特性进行分析，希望从41株变异链球菌临床分离株中筛选出高致龋性变异链球菌株。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

变异链球菌国际参考菌株Ingbritt（首都医科大学

附属北京口腔医院口腔医学研究所）；41株变异链球菌临床分离株[3]（从临床上分离获得，41株菌株已通过基因分型鉴定为不同基因型，其中1～10号菌株来源于无龋健康人，11～41号菌株来源于高龋患者）。

1.2 菌悬液的制备

将-70 ℃冻存的变异链球菌临床分离株41株及国际参考菌株Ingbritt复苏，接种于脑心浸液（brain-heart infusion，BHI）培养基中，37 ℃厌氧条件下培养24 h；再分别取各菌株的培养物100 μL，转种于20 mL BHI培养基中，37 ℃厌氧条件下培养至对数生长晚期（OD600约为0.5）。将42株菌株的培养物分别于4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min，弃上清液，收集细菌沉淀物，无菌中性PBS缓冲液洗菌2次，并重悬成菌悬液，细菌密度约为5×108 CFU·mL-1。

1.3 黏附实验[4-5]

1.3.1 唾液包被羟磷灰石（saliva-coated hydroxy-

apatite，SHA）的制备 取一健康成人进食2 h后的非

刺激性全唾液，冰浴，于4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，收集上清液，60 ℃水浴30 min以灭活蛋白酶，并用直径为0.45 μm的无菌针头式过滤器过滤以去除细菌和杂质，-20 ℃储存备用。

在分析天平上准确称取羟磷灰石颗粒4 mg，置于1.5 mL Eppendorf管中，高压灭菌；每管中加入已高压灭菌的黏附缓冲液200 μL（KCl 50 mmol·L-1、

KH2PO4 1 mmol·L-1、CaCl2 1 mmol·L-1、MgCl2

0.1 mmol·L-1，溶解于蒸馏水并调pH值至6.8后定容至200 mL），37 ℃水浴平衡过夜；然后吸去黏附缓冲液，每管加入已制备好的唾液100 μL，37 ℃、6 r·min-1旋转2 h，然后吸去唾液，用200 μL黏附缓冲液洗涤2次后，加入100 μL含5 g·L-1牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的黏附缓冲液，37 ℃、6 r·min-1旋转30 min，吸去液体，再用黏附缓冲液洗涤3次，即制备成SHA。

1.3.2 SHA黏附实验 分别取各变异链球菌临床分离株和国际参考菌株的菌悬液100 μL加入到含有4 mg SHA的Eppendorf管中，在37 ℃厌氧条件下，6 r·min-1旋转90 min；吸去菌液，用500 μL黏附缓冲液洗涤3次以去除未黏附的菌体细胞；吸去液体，每管加入200 μL无菌中性PBS缓冲液和无菌玻璃珠，用旋涡振荡器振荡混匀120 s，将已黏附至SHA上的菌体细胞从其上脱离下来并悬浮于中性PBS缓冲液中，即为原液。将原液用中性PBS缓冲液做10倍系列稀释，取10-2和10-3稀释液各100 μL，分别接种于轻型唾液链球菌-杆菌肽琼脂（mitis salivarius with bacitracin

agar，MSB）培养平板内，厌氧环境（80%N2、10%H2、

10%CO2）下，37 ℃培养48 h，计数培养平板上形成的菌落数并结合稀释倍数计算得到各菌株的菌落形成单位（CFU·mL-1），以间接反映菌株的黏附能力。每个样品一式三份，且实验重复3次。

1.4 合成细胞外多糖实验[6-7]

1.4.1 菌株细胞外多糖的制备 分别取各变异链球菌临床分离株和国际参考菌株的菌悬液，按菌液与培养基体积比为1∶10的比例将其接种至含1%蔗糖的BHI培养基中，37 ℃厌氧条件下培养24 h，将各菌株24 h培养物经4 ℃、5 000 r·min-1离心30 min，收集上清液后，细菌沉淀物用等同于培养基体积的蒸馏水洗涤并离心2次，合并3次上清液，作为水溶性细胞外多糖；水洗后的细菌沉淀物中加入等体积的0.5 mol·L-1 NaOH洗涤并离心3次，合并上清液，作为水不溶性细胞外多糖。两部分上清液各取5 mL，分别加入3倍体积的无水乙醇，4 ℃放置过夜，离心后弃水相；再分别于沉淀中加入5 mL的蒸馏水和0.5 mol·L-1 NaOH将其溶解，用蒽酮法测定水溶性及水不溶性细胞外多糖的含量。每个样品一式三份。

1.4.2 蒽酮法测定细胞外多糖含量 分别取葡聚糖稀释液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL，加入蒸馏水至1.00 mL，于15 ℃水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸液3.00 mL，搅拌3 min后放入95 ℃水浴中煮6 min，冷却；加样于96孔板中，每孔100 μL，每个样品一式三份；然后于酶联反应检测仪630 nm处测定吸光度值OD630，绘制标准曲线。

取样品1.0 mL，于15 ℃水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸液3.00 mL，搅拌3 min后放入95 ℃水浴中煮6 min，冷却；加样于96孔板中，每孔100 μL，每个样品一式三份；然后于酶联反应检测仪630 nm处测定吸光度值OD630。根据标准曲线及稀释倍数计算样品中多糖的含量。

1.5 耐酸实验[8]

分别取各变异链球菌临床分离株和国际参考菌株的菌悬液，按菌液与培养基体积比为1∶10的比例将其分别接种至初始pH值为4.0～7.0（以pH值0.5为间隔）的BHI培养基中，37 ℃厌氧条件下培养48 h。将各菌株48 h培养物经4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min，弃上清液，细菌沉淀物用5 mL无菌中性PBS缓冲液稀释，振荡器上混匀1 min，以无菌中性PBS缓冲液作阴性对照，于可见光分光光度计600 nm处测定吸光度值OD600。每个样品一式三份。

本研究用各菌株在不同pH值条件下OD600的平均值（用x表示）评价变异链球菌临床分离株耐酸能力的强弱。设pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时的OD600测量值分别为x1、x2、x3、x4、x5、x6、

x7，则x=（x1+x2+x3+x4+x5+x6+x7）/7。分别计算出临床分离株和国际参考菌株的OD600的平均值，比较其耐酸能力。

1.6 产酸实验[7-9]

分别取各变异链球菌临床分离株和国际参考菌株的菌悬液，按菌液与培养基体积比为1∶10的比例将其接种至含5%葡萄糖、初始pH值为4.0～7.0（以pH值0.5为间隔）的BHI培养基中，该pH值作为菌株生长前pH值，即pH0；37 ℃厌氧条件下培养48 h，培养物经4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min，取上清培养基，pH计测定pH值，作为菌株生长后pH值，即pH1。计算菌株代谢产酸，降低培养基pH值的能力，ΔpH=pH0-pH1。每个样品一式三份。

本研究用各菌株在不同pH值条件下ΔpH的平均值（用y表示）评价变异链球菌临床分离株产酸能力的强弱。因为测量结果显示，当pH值为4.0和4.5时，各菌株几乎都不产酸，因此本实验不进行pH值为4.0和4.5时的数据统计。设pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时的ΔpH分别为y1、y2、y3、y4、y5，则y=（y1+y2+y3+

y4+y5）/5。分别计算出临床分离株和国际参考菌株的ΔpH值，比较其产酸能力。

2 结果

2.1 变异链球菌临床分离株的黏附能力

变异链球菌对牙面的黏附存在非蔗糖依赖性和蔗糖依赖性黏附两种机制。本实验检测变异链球菌临床分离株在无蔗糖存在的条件下对SHA的黏附情况，比较各菌株之间黏附能力的差异。

通过计数培养平板上形成的菌落数，并结合稀释倍数计算得出各菌株的菌落形成单位（CFU·mL-1），

即黏附量（图1）。由图1可见，变异链球菌临床分离株对羟磷灰石的黏附量不同，绝大部分变异链球菌临床分离株的黏附量位于1.5×105～3.5×105 CFU·mL-1之间，仅38、16、33、17和12号变异链球菌临床分离株的黏附量高于此范围，3、1、5、4和9号变异链球菌临床分离株的黏附量低于此范围。

2.2 变异链球菌临床分离株合成细胞外多糖的能力

变异链球菌临床分离株合成水不溶性细胞外多糖的能力不同，绝大部分变异链球菌临床分离株合成水不溶性细胞外多糖的量位于0.010～0.020 g·L-1之间，仅17、33、12、2和11号变异链球菌临床分离株合成水不溶性细胞外多糖的量高于此范围，5、20、9、4、16、28、37、40和7号分离株合成水不溶性细胞外多糖的量低于此范围（图2）。

2.3 变异链球菌临床分离株的耐酸能力

在不同pH值条件下，各菌株的生长情况明显不同。随着pH值的降低，各菌株的生长均受到抑制。当外界环境的pH值持续降低、酸度继续增加时，对各菌株生长和繁殖的影响继续增大，pH值越低，抑制作用就越强。各菌株吸光度值越大，说明该菌株受到pH值变化的影响越小，该菌株的耐酸能力越强。各菌株在不同pH值条件下OD600的平均值测定结果见图3：绝大部分变异链球菌临床分离株OD600的平均值位于0.70～0.85之间，仅8、12、1、33、17、2和23号临床分离株高于此范围，29、5、21、4、9和26号临床分离株低于此范围。

2.4 变异链球菌临床分离株的产酸能力

在不同pH值条件下，各菌株的产酸能力明显不同。随着pH值的降低，各菌株的产酸能力均下降。当外界环境的pH值持续降低、酸度继续增加时，对各菌株产酸能力的影响持续增大，pH值越低，产酸情况就越差。各菌株ΔpH越大，说明该菌株产酸能力越强。各菌株在不同pH值条件下ΔpH的平均值测定结果见图4：绝大部分变异链球菌临床分离株ΔpH平均值位于1.6～1.8之间，仅14、12、33、17和29号临床分离株高于此范围，10、4、9、19、5、27和15

号临床分离株低于此范围。

2.5 变异链球菌高致龋性和低致龋性临床分离株的

鉴定

设黏附、合成水不溶性细胞外多糖、产酸和耐酸4项能力都强的变异链球菌临床分离株为高致龋性分离株，其中任何一项能力不强的，不归属于高致龋性菌株之列，低致龋性菌株与高致龋性菌株同理。综合分析变异链球菌临床分离株黏附、合成水不溶性细胞外多糖、产酸和耐酸的结果，可以发现：12、17和33号变异链球菌临床分离株的体外致龋能力均较强，4、5和9号临床分离株的体外致龋能力均较弱，提示12、17和33号可能为高致龋性临床分离株，4、5和9号可能为低致龋性临床分离株。

3 讨论

研究[1，9-10]表明：来源于同一患者口腔中的不同

基因型以及不同患者口腔来源的变异链球菌临床分离株的致龋能力存在显著差异。本研究结果发现：从临床上分离鉴定的41株变异链球菌临床分离株的黏附能力、合成水不溶性细胞外多糖能力、产酸能力和耐酸能力存在较大的差异，12、17和33号临床分离株的体外致龋能力均较强，4、5和9号分离株的体外致龋能力均较弱。根据该结果可以推测，从41株变异链球菌临床分离株中可能筛选出了3株高致龋性菌株和3株低致龋性菌株。

对牙面的黏附能力是变异链球菌重要的致龋特性之一。全唾液包被羟磷灰石模型是检测黏附能力的经典方法[4]，其优势在于：全唾液可在羟磷灰石颗

粒表面形成与体内唾液获得性薄膜相似的实验性薄膜，更能准确地模拟口腔内的情况。本实验采用洗脱培养法来测量各菌株的黏附能力，结果发现：41株变异链球菌临床分离株的黏附量不同，绝大部分菌株的黏附量为1.5×105～3.5×105 CFU·mL-1，国际参考菌株Ingbritt的黏附量也位于此范围内，仅38、16、33、17和12号菌株的黏附量较高，高于此范围，3、1、5、4和9号菌株的黏附量较低，低于此范围。

研究[11]证实：变异链球菌主要含有3种葡糖基转移酶（glucosyltransferase，GTF），即合成水不溶性葡聚糖的GTF-I和GTF-SI及仅合成水溶性葡聚糖的GTF-S。由于变异链球菌需要合成一定量的葡聚糖才能维持较高的黏附力，因此GTF对于介导该菌的黏附十分重要。能够利用蔗糖合成细胞外多糖被视为变异链球菌致龋的重要因素，而GTF的表达则是其基本要素[12-13]。细胞外多糖在菌斑致病过程中的作用是双重性的，水溶性细胞外多糖主要作为细胞外能源储备形式，有潜在产酸作用；而水不溶性细胞外多糖的抗水解能力和凝集黏附细菌作用都很强，不仅能促进菌斑的形成，还能作为菌斑的结构成分起作用，并限制了有机酸的扩散，降低了菌斑的pH值。

本实验采用蒽酮-硫酸法测定水不溶性葡聚糖。糖在强酸溶液中加热、脱水生成羟醛，再变成呋喃衍生物。此衍生物可与各种试剂反应生成有色物质，用分光光度计测得吸光度值计算出糖含量[12]。本实

验结果显示：41株变异链球菌临床分离株合成水不溶性葡聚糖能力不同，与文献报道一致[7]，绝大部分菌株合成水不溶性葡聚糖的量位于0.010～0.020 g·L-1之间，国际参考菌株Ingbritt的合成量也位于此范围内，仅17、33、12、2和11号菌株的合成量高于此范围，5、20、9、4、16、28、37、40和7号菌株的合成量低于此范围。

牙菌斑中的变异链球菌通过酵解局部微环境中的多种碳水化合物产酸，并能在酸性环境中生长代谢，避开唾液的缓冲作用，在菌斑微环境中长时间维持低pH值，致牙体硬组织脱矿，产生龋损。变异链球菌的产酸和耐酸性是致龋的直接原因，是其主要的致龋毒力因子之一。

pH值是细菌生长和代谢活动的重要影响因素。生长环境的酸化会使变异链球菌细胞内的pH值降低，导致细胞质酸化影响细胞内蛋白质活性及DNA分子，而糖酵解途径的酶也对酸敏感。虽然本实验只确定了培养基的初始pH值，而随着细菌的生长代谢，培养基的pH值是不恒定的，即都降至酸性pH，但是有学者[14]认为，初始pH值决定了变异链球菌对葡萄糖的利用率以及酸性终产物的形成；因此，本实验将变异链球菌菌株接种至不同初始pH值的培养基中，借以比较各菌株的产酸和耐酸能力；在接种增菌液之前，用无菌中性PBS缓冲液洗菌，排除了增菌培养基酸性环境对实验的影响。

产酸实验结果显示：在不同pH值条件下，各菌株的产酸能力明显不同，随着pH值的降低，各菌株的产酸能力均下降。当pH≤4.5时，各菌株均不再产酸，与Khoo等[7]的研究结果一致。41株临床分离株中

绝大部分菌株pH值变化的平均值为1.6～1.8，国际参考菌株Ingbritt的pH值变化也位于此范围内，仅14、12、33、17和29号菌株的pH值变化高于此范围，10、4、9、19、5、27和15号菌株的pH值变化低于此范围。

耐酸实验结果显示：在不同pH值条件下，各菌株的生长能力明显不同，随着pH值的降低，各菌株的生长能力均下降。41株变异链球菌临床分离株中，绝大部分菌株OD600平均值位于0.70～0.85之间，国际参考菌株Ingbritt OD600平均值也位于此范围内，仅8、12、1、33、17、2和23号菌株高于此范围，29、5、21、4、9和26号菌株低于此范围。

综合4项指标进行分析，可以发现：同一菌株黏附、合成细胞外多糖、产酸和耐酸能力有差异；在本实验条件下，同一菌株的某一项或某几项能力较高或较低；高龋患者口腔中存在低毒力株，无龋者口腔中不仅能够分离出变异链球菌，有些菌株的某一项致龋能力还比较高，这与Yamashita等[15]的研究结果一致。41株临床分离株中，12、17和33号可能为高致龋性变异链球菌临床分离株，而4、5和9号可能为低致龋性变异链球菌临床分离株；深入研究这些致龋能力不同的变异链球菌株，对认识龋病的病因和发病机制具有重要的意义。

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（本文编辑 吴爱华）