枯草芽孢杆菌XL05菌株的紫外诱变及发酵配方优化

辛 磊,安 慧,覃国乐,罗奉奉,李秀玲

(河池学院 化学与生物工程学院,广西 宜州 546300)

农业病虫害的常规防治主要以化学防治为主,如核桃根腐病的防治[1]、水稻细菌性条斑病的防治[2]、油茶炭疽病的防治[3]和小麦全蚀病的防治[4]等,不仅对环境造成一定的影响,而且也易引发病原菌的抗药性问题。随着人们对绿色环保的要求越来越高,化学药物防治所带来的弊端也越来越明显[5],农业种植模式也由常规农业向有机、生态农业发展[6]。生物防治因对土壤和环境生态安全,对人及动植物无毒副作用,不诱导病原菌产生抗药性的优点[7],在农业防治中发挥着越来越重要的作用[8]。从自然界分离获得的野生菌株,其药物代谢合成能力不论在产量还是质量上,均很难适应工业化生产的要求[9],故微生物的选育极为重要[10]。目前,菌株的选育多采用自然选育、诱变育种、转录、粒子流和等离子体等方法[11],而紫外诱变因设备简单、安全易操作和成本低等优点被广泛采用[12-13]。孟兆丽等[14]利用紫外诱变,选育出1 株遗传性稳定的枯草芽孢杆菌mutHS-301,抑菌活性提高了约20%;武晓雨等[15]利用紫外选育出耐高温新品种金西1号;赵玮钦等[16]利用紫外-微波复合诱变技术提高云芝菌对煤的溶解效果;程开勇等[17]验证微波和紫外2种方式对木霉T-YS菌株生长都具有明显的影响。

枯草芽孢杆菌具有良好的生物活性,可产生多种抗菌物质,抗逆性强,抗菌谱广;亦可产生类似植物生长激素、细胞分裂素的物质促进植物生长而被广泛应用于农业生产[18-19];申顺善等[20]从化香根际土壤种分离到多粘类芽孢杆菌HK18-8并验证该菌对辣椒炭疽病菌的防治效果达到88.58%;王波等[21]从大豆植株中筛选到的多粘类芽孢杆菌XZ-2对大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌均有较强的抑制作用。利用发酵配方优化,可提高目标菌株的活性物质产量和活性,陈胜杰等[22]对玉米秸秆生产燃料乙醇的工艺优化,乙醇质量浓度提高到26.4 g/L;范佳硕等[23]对植物乳杆菌的发酵配方进行优化,活菌数可达到3.9×109CFU/mL。本试验采用紫外诱变技术对枯草芽孢杆菌XL05的原始菌株进行紫外诱变,以期筛选到抗真菌生物活性较高的突变株,并对抑菌效果最好的突变株的发酵配方进行初步优化,以期更好地应用于生产实践。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

原始菌株为枯草芽孢杆菌XL05;病原菌为尖孢镰刀菌;供试菌株均为本试验室分离、鉴定和保存。

1.1.2 培 养 基

PDA培养基:土豆200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉20 g (种子培养基和发酵培养基不加),蒸馏水1 000 mL。

效价检测培养基同PDA培养基一致。

1.2 方 法

1.2.1 液体菌种的制备

将原始菌株活化后刮取一定量的菌体至种子培养基中,温度30 ℃,转速200 r/min,振荡培养20 h。

1.2.2 效价公式计算

将尖孢镰刀菌接种后培养10 d,制备孢子悬液,加入到效价检测培养基中,调整活菌数为4×104～6×104CFU/mL,将该混合培养基倒入培养皿,制成复合平板。

发酵液效价的测定采用杯碟法(标准曲线法)[24]。准确称取抗真菌活性物质将其配制成质量浓度5 g/L的水溶液,并稀释成质量浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0 g/L,进行生物测定。根据抗真菌活性物质质量浓度与抑菌圈直径的相对关系,以抗真菌活性物质质量浓度的对数值为横坐标,抑菌圈直径为纵坐标制作标准曲线,可得出效价计算公式。

1.2.3 XL05菌株的紫外诱变

将XL05菌株活化后,加入适量生理盐水,刮取菌苔,调整菌悬液活菌数为107～108CFU/mL,再将制备好的菌悬液进行紫外诱变。取不同照射时间的菌悬液涂布平板,按平板培养计数法计活菌数,以未经照射的菌悬液为对照,计算致死率,确定紫外诱变的最佳照射时间。致死率计算式为

1.2.4 诱变菌株的初筛

首先将诱变后的菌悬液稀释一定倍数,均匀涂布于添加少量该抗真菌活性物质的固体平板培养基上培养,然后将平板上生长迅速、菌落直径大的单株菌落挑出单独培养。

1.2.5 诱变菌株的复筛

将初筛得到的单株菌液体振荡发酵,重复2次,同时用原始菌做对照。发酵液高温灭菌后,低速离心取上清液效价检测,每株做3次重复,选取效价比对照高的菌株。

1.2.6 高产菌株的遗传稳定性测定

将复筛得到的高产菌株在培养箱内连续转接5代,每代均进行发酵及效价检测,每代做2次重复,确定高产菌株的遗传稳定性。

1.3 高产菌株发酵工艺优化

刮取菌株ZW75接种于发酵培养基中,28 ℃培养24 h。改变某一条件,并保持其他发酵条件不变,通过测量其效价,研究不同碳源、氮源和无机盐对效价的影响。

1.3.1 不同碳源对效价的影响

分别将不同质量分数的土豆(10%,20%,30%)、玉米粉(2%,4%,6%)、葡萄糖(2%,4%,6%)和乳糖(2%,4%,6%)加入到基础培养基中,配制含不同碳源的培养基,以基础培养基为对照,每种处理3个重复,测定其效价。

1.3.2 不同氮源对效价的影响

分别按照0.2%的配制将蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏粉和硫酸铵加入到基础培养基中,以基础培养基为对照,每种处理3个重复,测定其效价。

1.3.3 不同无机盐对效价的影响

分别按照0.1%的配制将CaCO3,MgSO4,NaCL,K2HPO4和KH2PO4加入到基础培养基中,以基础培养基为对照,每种处理3个重复,测定其效价。

1.3.4 发酵工艺的正交优化

选取对抗真菌活性物质效价影响显著的单因素进行正交试验设计,设计因素及水平如表1所示,每种处理2个重复。测定发酵液效价,验证最佳发酵条件。

表1 因素与水平的设置

2 结果与分析

2.1 效价计算公式

通过对效价的生物测定,可得到发酵液效价计算公式,即

(1)

式中:Y为发酵液效价(μg/mL);x为抑菌圈直径(12.0 mm

对抗真菌活性物质或发酵液效价进行生物测定时,将待测样品或发酵液稀释适当倍数,测量并记录抑菌圈直径,将数值代入式(1),计算发酵液效价。

2.2 最佳诱变时间

计算经紫外照射后,不同时间的菌株的致死率,并绘制致死曲线,如图1所示。由图1可看出:XL05菌株对紫外非常敏感,在20 s时致死率达到94.5%。为了保证较高的突变率,一般选择致死率在74%～95%为最佳紫外诱变时间,因为致死率太低其诱变效果不理想,太高则负突率增加,所以选择20 s作为紫外诱变时间。

图1 UV诱变时间与致死率间的关系

2.3 诱变高产菌株的初筛

抗真菌活性物质是目标菌正常生长所产生的次生代谢物,过多的次生代谢物会影响目标菌株的正常生长,能在含有一定量次生代谢物的培养基中生长,则说明该突变株能够产生更多的次生代谢物,利用该筛选培养基,可以筛选到高产菌株。经初筛后,共筛选到76株诱变株,划线培养,进行复筛。

2.4 诱变高产菌株的复筛

复筛后,共得到发酵液效价高于原始菌株1倍以上的诱变高产菌株5株,菌株编号为ZW08,ZW19,ZW35,ZW58和ZW75,结果如图2所示,其效价较原始菌株分别提高了1.25倍、1.40倍、1.35倍、1.38倍和1.36倍。

图2 高产突变株的复筛结果

2.5 高产突变株的遗传稳定性

筛选获得的5株高产突变株连续转接5代,结果如表2所示。从表2中可以看出:经过连续5代后,ZW19的发酵液效价上下浮动最大为10.1%,ZW75的发酵液前后5代的效价变化浮动只有1.01%,各突变株的效价基本不变,遗传性状稳定。

表2 高产菌株遗传稳定性

2.6 高产菌株发酵配方优化

诱变得到的5株高产突变株,经遗传稳定性实验得知:遗传性状稳定,尤其是ZW75菌株最稳定,故选取其进行发酵配方的初步优化。

2.6.1 不同碳源对菌株效价的影响

基础培养基因为选用的是PDA培养基,里面的主要成分也是土豆和葡萄糖,所以不同碳源对效价的影响不是很明显,如图3所示(其中碳源成分“土豆”简称“土”,“玉米粉”简称“玉”,“葡萄糖”简称“葡”,“乳糖”简称“乳”),葡萄糖对效价的影响略高,其添加量在4%时,效价最高,玉米粉、乳糖的影响略小。

图3 不同碳源对效价的影响

2.6.2 不同氮源对菌株效价的影响

不同氮源对菌株效价的影响如图4所示,蛋白胨和酵母浸膏粉能促进活性物质的产生,蛋白胨作为氮源时产生的活性物质的效价略高于酵母浸膏粉组,故选择蛋白胨作为最佳氮源。

图4 不同氮源对效价的影响

2.6.3 不同无机盐对菌株效价的影响

无机盐对菌株效价的影响如图5所示,从图5中可以看出:CaCO3对活性物质的效价影响最大,其效价最高,故选择CaCO3为最佳无机盐。

图5 不同无机盐对效价的影响

2.6.4 发酵培养基的正交优化

对优化后的发酵工艺进行验证,选择葡萄糖、蛋白胨和碳酸钙进行正交优化,结果如表3所示。优化后发酵效价可达到2 685.32 μg/mL,因此可确定该菌株的发酵工艺为葡萄糖4.0%、蛋白胨0.2%和CaCO30.1%,根据极差R的大小,对效价影响能力为葡萄糖>蛋白胨>CaCO3。

表3 正交优化分析

3 结 论

笔者选取对核桃根腐病有拮抗作用的枯草芽孢杆菌XL05进行诱变及开展发酵配方优化实验。经过初筛和复筛,得到5株较稳定的高产突变株,菌株编号为ZW08,ZW19,ZW35,ZW58,ZW75,其效价较原始菌株分别提高了1.25倍,1.4倍,1.35倍,1.38倍和1.36倍,且遗传性状稳定;对ZW75突变株的发酵配方进行初步优化,当葡萄糖4.0%、蛋白胨0.2%和碳酸钙0.1%时,发酵效价可达到2 685.32 μg/mL,根据极差R的大小,对效价影响能力为葡萄糖>蛋白胨>CaCO3。广西河池市自2012年以来,利用当地特有的喀斯特地貌和多山区优势,大力种植核桃,现已种植达到1 334 km2以上规模,极大地带动了当地的经济。随着种植面积的不断扩大,各种核桃病虫害也随即爆发,核桃业的发展受到了严重影响。为了避免化学药物对核桃及环境带来污染,该实验所得到的突变株发酵后,经中试及田间试验,可用于核桃根腐病的防治,为当地核桃的生物防治提供一个研究方向。