高效液相色谱法同时测定蛇莓提取物中4种成分的含量

耿丽，李聪，李志浩

(湖北医药学院附属东风医院药学部，十堰 442000)

蛇莓为蔷薇科植物蛇莓[Duchesneaindica(Andr.)Focke]的全草，味甘、苦，性寒，具清热解毒、凉血止血、散瘀消肿之功效，常用于热病、惊痫、感冒、痢疾、黄疸、目赤、口疮、咽痛、疔肿、毒蛇咬伤、吐血、崩漏、月经不调、跌打肿痛等治疗[1]。蛇莓始载于《名医别录》，而《本草纲目》则对其主要特征和生长环境进行了详尽描述：“蛇莓，就地引细蔓，节节生根，每枝三叶，叶有齿刻，四、五月开小黄花……当是取其茎叶并根也”。鉴于其上述主要特征，故蛇莓又名三爪龙、鸡冠果、龙吐珠、落地杨梅、血疔草及蛇皮藤等。据研究报道[2-3]，蛇莓中主要含有黄酮类、酚酸类、萜类、鞣酸花类及甾醇类等化合物。现代药理研究表明，蛇莓具有抗肿瘤[4]、降血糖及防治老年痴呆[5]、抗病毒[6]、抗氧化应激[7]、抗菌及调节免疫[8]等药理作用。本实验基于前期蛇莓物质基础的研究，拟以蛇莓提取物中香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚为检测指标，笔者参考文献[9-14]，采用高效液相色谱(HPLC)法，应用梯度洗脱，对提取物中的上述4种成分进行含量测定，为蛇莓相关功能性产品的深入开发提提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters高效液相色谱仪系统[沃特世科技(上海)有限公司]，EYELA旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)，Eppendorf 微量移液器(德国艾本德股份公司)，MJ超声清洗机(无锡市美极超声设备有限公司)。

1.2试药 香草酸对照品(批号：110776-201503)、异槲皮苷对照品(批号：111809-201804)、染料木素对照品(批号：111704-201703)及山柰酚对照品(批号：110861-201611)，均购自中国食品药品检定研究院。蛇莓购自安徽亳州药材市场(产地：四川泸州)，经湖北医药学院陈吉炎教授鉴定为蔷薇科植物蛇莓[Duchesneaindica(Andr.)Focke]的全草。蛇莓提取物(自制，批号：20180910，20180918，20180927)，乙腈(色谱级，德国默克)，纯化水(自制)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Kromasiol-100 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相组成：乙腈(A)-0.05%磷酸(B)进行梯度洗脱：0～10 min，10%→42%A；10～16 min，42%→60%A；16～30 min，60%→80%A；30～35 min，80%→90%A；流速：1 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：350 nm。

2.2蛇莓提取物制备 称取经烘干并粉碎过20目筛的蛇莓药材适量，加15倍量纯化水回流提取1次，而后加12倍量纯化水回流提取2次，抽滤，合并3次的蛇莓提取液，减压浓缩至相对密度为1.50，温度为90 ℃，浓缩液加95%乙醇以达50%含醇量，充分搅拌后静置15 h，取上清液减压浓缩。浓缩液经D101大孔吸附树脂充分吸附。为有效去除水溶性杂质、无机盐等，先用纯化水洗脱3个柱体积(3 BV)，而后采用25%乙醇洗脱2 BV，用65%乙醇洗脱5 BV，收集合并65%乙醇洗脱液，经减压浓缩并真空干燥，经双层封口袋和干燥器存放，待用。

2.3样品的制备

2.3.1对照品溶液的制备 称取干燥至恒质量的香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚对照品适量于量瓶中，精密称定，用乙腈溶解并定容，制得分别含香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚为123.8，282.4，153.2 和203.7 μg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.3.2供试品溶液的制备 称取蛇莓提取物50 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，先用2 mL的65%乙醇溶解，而后乙腈定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4方法专属性 按上述色谱条件HPLC进样分析，得到对照品和蛇莓提取物的HPLC色谱图，见图1。结果显示香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚的分离度良好，特异性高。

A.对照品；B.蛇莓提取物；1.香草酸；2.异槲皮苷；3.染料木素；4.山柰酚。

2.5线性关系考察 精密吸取“2.3.1”项所制的对照品溶液适量于10 mL量瓶中，加乙腈分别制成香草酸浓度为3.095，6.19，12.38，30.95，61.9，123.8 μg·mL-1、异槲皮苷浓度为7.06，14.12，28.24，70.6，141.2，282.4 μg·mL-1、染料木素浓度为3.83，7.66，15.32，38.3，76.6，153.2 μg·mL-1、山柰酚浓度为5.092 5，10.185，20.37，50.925，101.85，203.7 μg·mL-1系列对照品溶液。按上述色谱条件HPLC进样分析，记录峰面积，以峰面积(Y)对对照品溶液浓度(X)进行线性回归，香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚分别在3.095～123.8，7.06～282.4，3.83～153.2和5.092 5～203.7 μg·mL-1范围内线性关系良好，其回归方程分别为Y=5.831 2×105X+427.3(r=0.999 9)、Y=1.135 9×106X-372.5(r=0.999 8)、Y=6.625 8×105X-418.9(r=0.999 7)、Y=9.295 1×105X+429.5(r=0.999 9)。

2.6精密度实验 精密吸取含香草酸30.95 μg·mL-1、异槲皮苷70.6 μg·mL-1、染料木素38.3 μg·mL-1、山柰酚50.925 μg·mL-1的混合对照品溶液连续进样6针，记录峰面积，结果显示香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚峰面积RSD分别为1.42%，1.05%，1.26%及1.13%，均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.7重复性实验 称取蛇莓提取物(批号：20180910)6份，每份50 mg，精密称定，按“2.3.2”项制备供试品溶液，经孔径0.45 μm滤膜滤过后HPLC分析，记录香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚峰面积并计算提取物中各成分的含量。结果显示蛇莓提取物中的香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚的含量分别为5.826，17.512，8.974和10.739 mg·g-1，各成分峰面积RSD分别为1.37%，1.21%，1.44%及1.16%，均小于2%，表明方法重复性良好。

2.8稳定性实验 按“2.3.2”项下制备供试品溶液，经孔径0.45 μm滤膜滤过后，分别在0，1，2，3，6，9，12，24，48 h经HPLC分析测定，记录香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚4种成分的峰面积，结果上述4种成分峰面积RSD分别为1.29%，1.43%，1.18%及1.35%，均小于2%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.9加样回收率实验 称取已知含量的蛇莓提取物(批号：20180910)6份，每份25 mg，精密称定，加入65%乙醇2 mL溶解，再加入3 mL含香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚分别为61.9，141.2，76.6及101.85 μg·mL-1的对照品溶液，于10 mL量瓶中乙腈定容，经孔径0.45 μm滤膜滤过后HPLC分析，计算加样回收率及RSD，结果见表1。

表1 4种成分加样回收率结果

2.10样品测定 称取批号为20180910，20180918，20180927的蛇莓提取物各50 mg，精密称定，制备供试品溶液，经孔径0.45 μm滤膜滤过后HPLC分析，记录峰面积并计算蛇莓提取物中香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚的含量，结果见表2。

表2 蛇莓提取物中香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚含量

3 讨论

3.1检测波长的确定 分别将香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚4种成分的单一对照品溶液经紫外全波长扫描，发现香草酸在波长327和260 nm处有最大紫外吸收，异槲皮苷在波长356和255 nm处有最大紫外吸收，染料木素在波长363和259 nm处有最大紫外吸收，山柰酚在波长368和252 nm处有最大紫外吸收，综合上述4种成分的最大紫外吸收，初步选择350和260 nm作为检测波长，但后续实验发现供试品溶液在350 nm波长检测时基线更为平稳，故最终选择350 nm作为本实验的检测波长。

3.2流动相的确定 初始采用甲醇-水以及乙腈-水系统等度洗脱检测供试品溶液中香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚4种成分，结果供试品中香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚以及其他成分难以达到完全分离，故进一步采用梯度洗脱系统对蛇莓提取物中上述4种成分进行测定，结果发现乙腈-水梯度洗脱能够使得香草酸、异槲皮苷、染料木素、山柰酚以及其他成分分离度良好。由于香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚四种成分均含有酚羟基，在水中易发生电离，产生拖尾，故在流动相中加入不同比例浓度的甲酸、磷酸及冰醋酸，结果表明当加入0.05%磷酸可使峰型显著改善。

本实验研究建立了同时测定蛇莓提取物中香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚含量的HPLC法，通过HPLC测定得出蛇莓提取物中香草酸、异槲皮苷、染料木素及山柰酚含量分别为5.904，17.535，9.011，10.788 mg·g-1。该方法简便快捷、准确可靠，重复性高，可为蛇莓提取物的质量评价与控制奠定实验基础。