抗坏血酸插层铁锆氧化物的制备及急性毒性评价

2020-08-10杨玉洁张毅伟彭达赵爽张庆乐王浩

医药导报 2020年8期

杨玉洁，张毅伟，彭达，赵爽，张庆乐，王浩

(山东第一医科大学药学院临床药学教研室，泰安 271016)

抗坏血酸在治疗坏血病、增强免疫力、预防恶性肿瘤等方面具有良好的效果[1-3]，但由于稳定性较差，易溶于水而损失[4]，需制成缓释制剂以保证其治疗效果。与纤维素衍生物、壳聚糖和胶原等传统的药物缓释材料相比[5]，层状双金属氧化物具有特殊的层状结构和较大的比表面积、良好的生物相容性和稳定性，成为极具开发潜力的新型药物缓释载体[6-9]。以植物提取液为软模板合成层状双金属氧化物是国际先进合成方法，该方法利用植物提取液中含有的多酚、黄酮、还原糖和蛋白质等生物活性成分作为还原剂和稳定剂，在相对温和的反应条件下对材料的形貌结构进行人工调控，从而提高对目标药物的负载率和缓释性能[10-12]。

树叶来源广泛，品种繁多，成为合成纳米金属或金属氧化物的首选模板材料，如MACHADO等[11]利用桑树叶、苹果叶、柠檬叶等26种叶片提取液合成纳米铁，陈波等[12]利用红背桂叶、桉树叶和樟树叶的提取液绿色合成氧化铁。笔者在本文以松针提取液为软模板合成铁锆双金属氧化物，探讨材料的制备条件对抗坏血酸负载能力的影响；利用体外实验评价抗坏血酸插层铁锆氧化物在模拟胃液和肠液中的缓释效果，并利用急性毒性实验评价该材料的生物安全性。

1 材料与仪器

1.1试验材料抗坏血酸(批号：20180622，含量>99.7%)、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTMAB)(批号：57-09-0)、三氯化铁(批号：7705-08-0)和氯氧化锆(批号：13520-92-8)等均为分析纯，购自南京细诺化工科技有限公司。

1.2试验仪器 Spectrumlab752s紫外-可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；HY-5A型回旋式振荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；PHS-25C酸度仪(杭州奥立龙有限公司)；HH-6J数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司)；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

2 试验方法

2.1松针水提液的制备将采摘的松针洗净，置于60 ℃的烘箱内干燥24 h，用粉碎机粉碎，松针粉和纯化水按质量比1：20的比例加入到蒸馏烧瓶中，80 ℃的恒温水浴锅加热1 h，真空抽滤后得松针水提液。

2.2铁锆氧化物的制备将一定量的三氯化铁、氯氧化锆和十六烷基三甲基溴化铵加入到盛有松针水提液100 mL的烧杯中，置于磁力搅拌器上连续搅拌60 min，使其混匀。0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液逐滴滴定，调节溶液的pH值为9.5。将烧杯封口置于80 ℃的烘箱内陈化24 h，抽滤后将滤渣置于105 ℃下干燥24 h。残渣在500 ℃下煅烧2 h，得到铁锆氧化物。改变铁锆氧化物中铁和锆的含量及比例、十六烷基三甲基溴化铵的加入量、反应温度和烘干时间等条件制备一系列的铁锆氧化物。

2.3抗坏血酸负载方法将铁锆氧化物0.1 g加入到盛有浓度为20 mg·L-1抗坏血酸100 mL的锥形瓶中，置于恒温振荡器上进行震荡反应，待反应达到平衡后，抽滤。利用紫外-可见分光光度计在波长245 nm处测定滤液的吸光度，利用下式(1)计算抗坏血酸的负载率：

R=C0-CeC0×100% (1)

式中：R为抗坏血酸负载率(%)；C0为抗坏血酸初始浓度(mg·L-1)；Ce为抗坏血酸平衡浓度(mg·L-1)。

2.4抗坏血酸缓释量的测定参照2010年版《中华人民共和国药典》中方法配制人工胃液和肠液来模拟人体内环境。利用最佳条件下合成的铁锆氧化物对抗坏血酸进行负载，制备抗坏血酸插层铁锆氧化物复合材料。将抗坏血酸插层铁锆氧化物复合材料0.1 g放入盛有人工胃液和肠液20 mL锥形瓶中，置于恒温振荡器上进行缓释实验，分别于5，10，15，30，45，60，90，120，180，240，330和450 min取样，测其吸光度，并计算抗坏血酸的缓释量。

2.5急性毒性试验配制浓度为9.88，14.82，22.22和33.33 mg·mL-1铁锆复合物的混悬液。取健康昆明种小鼠[购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：11400700221315，实验动物生产许可证号SCXK(京)2016-0011，实验动物使用许可证号：SYXK(鲁)2012-0005]，雌雄各半，体质量22～24 g，分为4组(n=6)，采用口服灌胃法一次性依次给药，灌胃剂量以20 mL·kg-1。每天记录小鼠的体质量、食量变化情况，并观察其排便情况及有无嗜睡的现象，连续观察10 d，对铁锆复合物的急性毒性进行初步观察。

3 结果

3.1制备条件对抗坏血酸负载率的影响

3.1.1铁锆摩尔比的影响在100 mL松针提取液、0.5 g CTMAB中，依次添加不同摩尔质量的三氯化铁和氯氧化锆(摩尔比分别为8：1，4：1，1：1、1：4，1：8)，使二者的总量为0.01 mol，采用化学沉淀法合成铁锆氧化物，并对抗坏血酸进行负载。由图1可知：当铁锆摩尔比为8：1时，该复合氧化物对抗坏血酸的负载率达到最大值91.76%。随着铁锆摩尔比的增加，铁锆氧化物对抗坏血酸的负载率逐渐降低到76.11%。因此，选择铁锆摩尔比为8：1时制备该复合氧化物效果较好。

图1 铁锆摩尔比对抗坏血酸负载率的影响

3.1.2CTMAB加入量的影响在100 mL松针提取液、0.01 mol三氯化铁和氯氧化锆(铁锆摩尔比为8：1)溶液中，依次加入CTMAB 0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 g，采用化学沉淀法合成铁锆氧化物，并对抗坏血酸进行负载。由图2可知：随着CTMAB质量从0.1 g增加到0.5 g，铁锆复合物对抗坏血酸的负载率从73.73%逐渐增加到 90.31%。继续增加CTMAB质量，铁锆复合物对抗坏血酸负载率基本趋于稳定。所以，CTMAB的适宜质量为0.5 g。

图2 CTMAB加入量对抗坏血酸负载率的影响

3.1.3反应温度的影响烧杯中加入100 mL松针提取液、0.01 mol三氯化铁和氯氧化锆(摩尔比为8：1)和0.5 g CTMAB，置于温度分别为20，40，60，80和100 ℃的磁力搅拌器上持续搅拌60 min，采用化学沉淀法合成铁锆氧化物，并对抗坏血酸进行负载。由图3可知：随着反应温度的增加，铁锆复合物对抗坏血酸的负载率呈现明显的先增加后降低的趋势，当反应温度为60 ℃时，铁锆复合氧化物对抗坏血酸的负载率达到最大值为96.71%。所以，铁锆复合物最适宜的反应温度为60 ℃。

图3 反应温度对抗坏血酸负载率的影响

3.1.4烘干时间的影响烧杯中分别加入松针提取液100 mL、0.01 mol三氯化铁和氯氧化锆(摩尔比例为8：1)和CTMAB 0.5 g，置于60 ℃的磁力搅拌器上持续搅拌60 min，改变烘干时间分别为0，1，2，4，8，12，24，36和48 h，采用化学沉淀法合成铁锆复合氧化物，并对抗坏血酸进行负载。由图4可知，当烘干时间为0～24 h时，铁锆氧化物对抗坏血酸的负载率随着烘干时间的延长从73.08%增加到97.82%，当烘干时间36和48 h时，铁锆氧化物对抗坏血酸的负载率分别为97.89%和97.96%，仅有略微增加。综合考虑药物负载率和烘干时间，确定最适宜的烘干时间为24 h。

图4 烘干时间对抗坏血酸负载率的影响

3.2抗坏血酸缓释量的测定由图5可知，在人工胃液中，制剂中抗坏血酸的释放量随着时间推移逐渐增加。在0～240 min范围内，释放量增速较明显，此后增速放缓，在450 min时释放量达到极大值73.43%。在人工肠液中，制剂中抗坏血酸的释放量随着时间延长逐渐增加，在0～200 min范围内，抗坏血酸的释放量增速较明显，此后增速放缓，在450 min时释放量达到极大值63.74%。总体来看，不同时间内在人工胃液中抗坏血酸的释放量均高于人工肠液中抗坏血酸的释放量。

图5 抗坏血酸在模拟胃液和肠液中的缓释量

3.3急性毒性实验纳米金属氧化物在生物和医学领域广泛应用，如氧化铁因其良好的生物相容性和独特的超顺磁性，被用作缓释药物的载体材料；氧化锆应用于牙科和人工支架领域，均被证实无明显细胞毒性和动物急性毒性[13-14]。本文铁锆复合氧化物合成工艺中未加入任何有毒试剂，为进一步确证其安全性，进行了复合物急性毒性的初步实验。以质量浓度为1.976和2.964 g·kg-1的铁锆化合物灌胃时，小鼠体征变化均正常；以质量浓度为4.44 g·kg-1的铁锆化合物灌胃时，小鼠食欲稍有下降；以质量浓度为6.666 g·kg-1的铁锆化合物灌胃时，小鼠仅食欲稍有下降且短时少动，但并无死亡。根据2005年《化学药物急性毒性试验技术指导原则》最大给药量法，给药量>5 g·kg-1未有动物死亡，可初步推测铁锆化合物无明显的急性毒性，结果见表1。但铁锆化合物对于机体各组织器官有无病理学损伤，还有待进一步研究。

表1 小鼠急性毒性实验结果

4 讨论

松针提取液含有黄酮、多糖、多酚、蛋白质、莽草酸等多种有效成分，可改变铁锆氧化物的形貌结构，从而影响其对抗坏血酸的载药率。CTMAB是一种典型的阳离子表面活性剂，可减少铁锆氧化物颗粒在溶液中的聚集，提高其比表面积和对抗坏血酸的载药率。通过单一因素的实验结果可以看出，当三氯化铁和氯氧化锆的摩尔比为8：1、加入0.5 g CTMAB、反应温度为60 ℃、烘干时间为24 h时，合成的铁锆氧化物对抗坏血酸的最大负载率为97.82%。随着反应时间的延长，抗坏血酸插层铁锆氧化物中的药物向模拟胃液和肠液中逐渐释放，从而使药物释放率随时间延长而逐步增加，当反应时间为450 min时，最大释放率分别为73.43%和 63.74%。基于急性毒性的实验结果可以看出，铁锆氧化物并无明显急性毒性，适宜作为抗坏血酸的缓释材料。