芦根多糖诱导自噬和凋亡抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖

邓小娟，敖素华

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院门诊部，成都 610072；2.西南医科大学附属中医医院肺病科，泸州 646000)

肺癌在我国具有高发病率和高死亡率等特点，这一大难题长期困扰着临床医生。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌主要的类型，约占80%[1]。目前临床上常用治疗方法包括手术、放化疗等，但其疗效多数仍不尽人意，临床治疗失败的主要原因为肿瘤的复发与转移。由于恶性肿瘤的发生发展涉及多因素、多途径、多环节等过程，目前临床上使用的单靶点药物常常不能达到令人满意的效果。中药是药用化合物的天然宝库，同时也是发现新型活性化合物的重要途径。许多报道证实，某些中药成分具有促进细胞凋亡、激活自噬的活性[2-4]。芦根常用于治肺热咳嗽、肺痈吐脓、大叶性肺炎等[5-8]。调查显示，许多经典名方中均加入以芦根为原料的中药治疗肺癌，可显著抑制肺癌发展并改善肺功能[9-13]。其中，芦根多糖具有多方面药理活性，如提高机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等[14]。这些研究均提示芦根多糖可能具有显著的抗肺癌作用。然而，芦根多糖是否对NSCLC具有显著的抑制作用，有待深入研究。因此，本课题以前期研究为基础，通过体外及体内模型，开展芦根多糖对NSCLC抑制的作用及机制研究，为中药芦根抗肺癌活性的开发应用奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 A549细胞：NSCLC细胞系，来源于CCTCC武汉细胞库。本实验室长期传代保存，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37 ℃、5%CO2及相对湿度95%条件下常规培养。

1.1.2动物 Balb/c裸鼠：无特定病原体(SPF)级，4～6周龄，雄鼠，体质量16～20 g。购自成都达硕实验动物有限公司。动物生产许可证号：SCXK(川)2013-24。饲养间温度：25～26 ℃，饲养间湿度：55%～70%，12 h明暗交替，常规全价繁殖期饲料喂养，自由饮水。

1.1.3药物与试剂 芦根(四川省中药饮片有限责任公司，批号：180528)；芦根多糖：由实验室前期制备分离，提取率为1.64%，本实验室4 ℃保存。顺铂(Cis-platinum，DDP)，每瓶0.02 g，批号：1WA2A1311031B。RPIM 1640培养基(Gibco，批号：1848026)；CCK-8细胞活力试剂盒(Dojindo，批号：GB707)；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：C3062M)；磷酸盐缓冲溶液-PBS粉末(索莱宝生物科技有限公司，批号：P1010)；二甲亚砜(Dimethyl suphoxide，DMSO，Sigma公司，批号：SHBH7843)；Caspase-3抗体(美国abcam生物科技公司，批号：ab69482)；PI 3 Kinase p110α Goat mAb(Cell Signal Technology，批号：4249)；Phospho-PI 3 Kinase p85(Tyr458)/p55(Tyr199)Antibody(Cell Signal Technology，批号：4228)；Akt Rabbit mAb(Cell Signal Technology，批号：4603)；Phospho-Akt(Ser473)Rabbit mAb(Cell Signal Technology，批号：4080)；Bcl-2(D 55G 8)Goat mAb(Cell Signal Technology，批号：4223)；β-Actin(13E 5)Goat mAb(Cell Signal Technology，100 μL，批号：4970)；Anti-Rabbit IgG(Cell Signal Technology，批号：4414)。

1.1.4主要实验设备 二氧化碳培养箱(Thermo，USA，型号：LS-C 0150)；洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-2FD)；多模式微孔检测仪(美国Bio-Tek，USA，型号：Cytation3)；倒置相差荧光显微镜(日本Nikon，型号：TS 100)；电子天平(美国OHAUS，型号：AR 2140，感量：0.01 mg)；流式细胞仪(美国BD生物科技公司，型号：FACSVerse)；移液器(德国Eppendorf系列，2.5～1000 μL)；高速离心机(广州科栢实验器材有限公司，型号：lwicrfuge16)。

1.2方法

1.2.1工作液配制 芦根多糖工作液：取40 mg芦根多糖，加入1 mL PBS中配制浓度为40 mg·mL-1，临用前用RPMI 1640培养基稀释至4，2，1，0.5，0.25 mg·mL-1，备用。顺铂工作液配制：取1瓶顺铂，每次给药前取100 μL加2400 μL生理盐水至2.5 mL。顺铂溶液配制在通风橱中进行，配制后密封备用。

1.2.2小鼠A549肺癌移植瘤模型建立 取对数生长期的A549细胞，胰蛋白酶消化及培养基终止消化后离心，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，调整细胞密度为1×107个·mL-1。将细胞悬液接种于裸鼠右侧腋下，每只接种0.1 mL，7 d后瘤体形成，建立NSCLC A549移植瘤模型。A549细胞接种到裸鼠身上13 d后，若小鼠瘤体体积达到90 mm3，则表明A549裸鼠移植瘤模型成功。

1.2.3芦根多糖对A549细胞及在体肺癌移植瘤的抑制作用 将移植瘤模型小鼠随机分为3组，即顺铂组(2 mg·kg-1，每2天腹腔注射1次，9次)，芦根多糖组(100 mg·kg-1，每天灌胃1次，连续给药18 d)和对照组(与芦根多糖组等体积的配制的芦根多糖溶剂，每天灌胃1次，连续给药18 d)。

密切观察小鼠造模前后及给药前后的精神状态、饮食、体质量变化及死亡情况。分别于首次给药后第3，6，9，12，15，18天测量肿瘤体积(V=1/2ab2，a表示肿瘤最长半径，b表示肿瘤最短半径)，绘制肿瘤瘤体生长曲线图。末次给药后24 h处死，解剖取瘤，记录瘤体质量，剥取肿瘤组织，并将其固定于10%甲醛溶液中，且剪取部分肿瘤组织冻存于液氮中。

计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率(%)=(对照组肿瘤体积-药物组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%。

1.2.4CCK-8检测细胞活性 芦根多糖处理A549细胞48 h后，将处于对数生长期细胞接种在96孔板中，浓度调整为5×104个·mL-1，加细胞悬液每孔100 μL，细胞贴壁后，每孔加CCK-8 10 μL，孵育2 h，450 nm处测吸光度值(A)。根据A值计算抑制率，抑制率(%)=(对照组A-药物组A)/对照组A×100%。

1.2.5流式检测细胞凋亡 药物干预：以细胞密度为每孔4×105个接种于6孔板，每孔900 μL，设置芦根多糖组、空白对照组，每组三个复孔。48 h后，芦根多糖组加入芦根多糖工作液(100 mg·mL-1，100 μL)，空白对照组加入RPMI 1640培养基100 μL。

流式检测细胞凋亡：48 h后取出6孔板，弃去全部上清液，使用PBS液，清洗细胞2次。胰酶消化、离心、PBS重悬，调整细胞密度为1×106个·mL-1。按照Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒说明书要求，取细胞悬液100 μL于EP管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，用枪头轻轻混匀，室温避光孵育15 min。随后，将EP管中的全部液体转移至流式检测管中，再加入400 μL PBS，混匀，上机检测。流式细胞结果按照不同象限区分，Q 1区：PI(+)AnnexinV(-)，代表机械性死亡细胞区；Q2区：PI(+)AnnexinV(+)，代表晚期凋亡细胞区；Q3区：PI(-)AnnexinV(+)，代表早期凋亡区；Q4区：PI(-)AnnexinV(-)，代表活细胞区。

1.2.6Western blotting检测LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，PI3K，p-PI3K，AKT及p-AKT蛋白表达水平 将细胞以密度为每孔4×105个接种于6孔板中，加入芦根多糖工作液(100 mg·mL-1，100 μL)，孵育48 h后，提取蛋白，测含量。跑胶、电泳1.5 h、转膜 2.5 h、封闭1.5 h。一抗 4 ℃过夜，二抗孵育 2 h，显色，凝胶图像分析软件对结果进行灰度分析。

1.2.7免疫组化法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达 肿瘤组织在10%甲醛溶液中固定12 h后，常规石蜡包埋切片，3%H2O2清除内源性过氧化酶，并进行热修复抗原；加入一抗(Bax，1：100；Bcl-2，1：250；Caspase-3，1：25稀释)，37 ℃ 孵育；加入HRP标记的二抗孵育；DAB 显色，苏木精复染；镜检。

1.3统计学方法 数据处理采用SPASS 21.0版统计软件，结果用均数±标准差(x±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用 LSD 法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同浓度芦根多糖对A549细胞活性的影响 根据抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则，抑制率大于30%认为药物对肿瘤细胞较为敏感。将不同浓度芦根多糖分别干预A549细胞24，48及72 h后，使用CCK-8试剂盒对细胞活力进行检测，结果发现芦根多糖在浓度100 μg·mL-1，干预48及72 h时，对A549细胞的增殖抑制率最佳，大于30%(P<0.05)，见图1。

①与对照组比较，P<0.05。

2.2芦根多糖显著促进A549细胞凋亡 为进一步探讨芦根多糖对A549细胞增殖活性的抑制效应是否与细胞凋亡相关。利用流式细胞技术检测芦根多糖干预后的A549细胞凋亡情况，结果发现与对照组比较，芦根多糖组早期凋亡(Annexin-V+/PI-，Q3象限)和晚期凋亡(Annexin-V+/PI+，Q2象限)细胞的比例明显升高(P<0.05)，见图2。提示芦根多糖具有促进A549细胞凋亡的作用。

2.3芦根多糖促进A549细胞自噬 为进一步探讨芦根多糖抑制A549细胞增殖是否亦与激活细胞自噬有关，利用western blot对自噬激活关键蛋白LC3以及自噬经典信号通路PI3K-AKT相关蛋白进行检测。LC3蛋白是一种自噬标记物，自噬激活后LC3-Ⅰ会通过酶解一小段多肽转变成LC 3-Ⅱ，因此LC 3-Ⅱ/Ⅰ比例增加提示自噬激活[15]。结果发现，与对照组比较，芦根多糖组LC 3-Ⅱ/Ⅰ比值明显升高(P<0.01)，表明A549细胞自噬被激活；尽管与对照组比较，芦根多糖干预A549细胞后其AKT、PI3K总蛋白表达无显著变化(P>0.05)，但p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K比值显著升高(P<0.01)，结果见图3。

A.对照组；B.芦根多糖组；C.A549细胞凋亡率；①与对照组比较，P<0.01。

①与对照组比较，P<0.01。

2.4芦根多糖对A549移植瘤裸鼠模型的体内药效学研究

2.4.1一般性观察 在小鼠腋下接种A549细胞，接种后7 d时肉眼可见肿瘤，到第13天时肿瘤体积达90 mm3，成功率90.0%。移植瘤模型建立后小鼠精神萎靡，食欲不振，活动减少，体质量下降。

2.4.2芦根多糖对A549移植瘤小鼠肿瘤体积及质量的影响 移植瘤模型建成后，予以小鼠芦根多糖治疗，观察其对小鼠肿瘤的影响。与对照组比较，给药后第9天开始，药物治疗组(芦根多糖、顺铂)能明显抑制小鼠肿瘤体积的生长(图4)，其中顺铂与芦根多糖组肿瘤生长曲线相似，提示芦根多糖与顺铂对肿瘤生长具有相似的抑制效果。给药第18天后，与对照组比较，药物治疗组(芦根多糖、顺铂)肿瘤质量低于对照组，顺铂和芦根多糖对小鼠肿瘤的抑制率分别为39.1%，35.9%(表1)。

表1 芦根多糖对A549移植瘤裸鼠肿瘤的抑制率

2.4.3芦根多糖对A549移植瘤小鼠脏器指数的影响 脏器指数是动物脏器的质量与其体质量之比，主要反映药物对机体的毒性。与对照组比较，药物治疗组(芦根多糖、顺铂)小鼠的肝脏及脾脏指数无明显变化(表2)。

①与对照组比较，P<0.01。

表2 芦根多糖对A549移植瘤小鼠肝脏、脾脏指数的影响

2.5芦根多糖对A549移植瘤小鼠Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响 利用免疫组化染色检测芦根多糖治疗后对A549移植瘤小鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响，与对照组比较，药物治疗组(顺铂、芦根多糖)能明显抑制Bcl-2的表达(P<0.05)；相反，药物治疗组能显著促进Bax、Caspase-3的表达(P<0.05)，见图5。

3 讨论

近年来研究发现，中医经典名方对肺癌有一定的抗癌作用，其中芦根多糖具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多重功效[14]，但其是否亦可抑制NSCLC的增殖仍不清楚。因此，本研究通过动物和离体细胞实验探讨了芦根多糖对A549细胞及其移植瘤小鼠模型的治疗效应。本研究结果发现芦根多糖可通过促进细胞凋亡和增强细胞自噬进而抑制A549细胞的增殖和小鼠肿瘤的生长。

考虑到A549细胞株来源于临床患者肺肿瘤组织[16]，较为符合临床特征，而且曾经广泛用于治疗肺癌药物开发(如紫杉醇、多烯紫杉醇、贝伐单抗等)，受到行业认可。因此，A549细胞成为肺癌药物开发过程中的一种经典的筛选模型。为此，本研究利用A549细胞株建立NSCLC的体外、体内模型，用于评价和探究芦根多糖抑制NSCLC的药效作用及其分子机制。此外，临床证据表明顺铂联合放疗对晚期NSCLC具有良好的治疗作用[17]，成为化疗药物中铂类制剂的首选。因此，选择顺铂作为NSCLC移植瘤模型的阳性对照药物。

①与对照组比较，P<0.05；②与对照组比较，P< 0.01。

芦根味甘，性寒，入肺经，善清透肺热，常用于治肺热咳嗽、肺痈吐脓、大叶性肺炎等，在中医治疗肺癌的诸方、民间验方中均有应用。芦根中糖类成分的含量较高，约含51%多糖，前期研究表明芦根多糖具有抗Hela肿瘤细胞及B16细胞活性[18]，提示芦根多糖可能对肺癌也具有一定的治疗作用。鉴于细胞凋亡和自噬在肿瘤细胞增殖中具有重要作用[19]，笔者在明确了芦根多糖可显著抑制A549细胞及移植瘤小鼠肿瘤的增殖基础上，进一步探讨了其发挥抑制效应的潜在机制。研究结果发现芦根多糖可上调A549细胞移植瘤小鼠肿瘤组织促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达。提示芦根多糖可能促进A549细胞产生细胞凋亡效应，抑制移植瘤小鼠A549肿瘤组织形成。此外，还发现芦根多糖干预治疗后可显著增加LC-3Ⅱ/Ⅰ比例，且AKT、PI3K磷酸化水平增加，表明芦根多糖可激活细胞自噬，抑制A549细胞增殖，进而显著抑制A549细胞移植瘤小鼠的肿瘤生长。体内实验发现芦根多糖对A549细胞移植瘤小鼠肝脏、脾脏功能无明显影响，表明芦根多糖具备潜在的抗癌药物特性。

综上所述，芦根多糖可能通过促进肿瘤细胞凋亡和自噬，抑制NSCLC A549细胞增殖，为其作为一种潜在的NSCLC候选治疗药物。