近红外光响应性盐酸多柔比星脂质体的制备与表征*

祝侠丽，李玲华，王莎莎，巴妍妍，贾永艳

(河南中医药大学药学院，郑州 450046)

近红外光响应的肿瘤光热治疗(photothermal therapy，PTT)由于组织穿透性强、生物安全性好已引起广泛关注[1-2]。作为新兴的光敏剂，硫化铜纳米材料具有成本低、易合成、毒性低等优点，已在肿瘤PTT治疗领域表现出巨大潜力[3-4]。但纳米硫化铜本身很难通过调节温度而控制药物在肿瘤部位释放[5]。脂质纳米递药载体具有肿瘤靶向性，结合局部加热可增强纳米载体在肿瘤血管的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)，同时高热可促使脂质纳米递药载体中的药物在肿瘤组织释放[6]。本课题拟以盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride，DOX)为模型药物，采用课题组合成的亲水性纳米硫化铜(PVP/CuS)为光敏剂，制备近红外光响应性的盐酸多柔比星脂质体(DOX-PVP/CuS-Lip)，并对其理化性质进行表征。

1 仪器与试药

1.1仪器 N-1100-OSB-2100型旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；92-llN型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Nano-ZS90电位及粒度分析仪；JEM-1400型透射电镜(日本电子株式会社)；808 nm激光器(中国科学院院长春激光所)。

1.2试药 盐酸多柔比星(DOX，大连美伦生物技术有限公司，纯度≥99%，批号：25316-40-9)；豆磷脂(天津市光夏精细化工研究所，批号：20160403)；胆固醇(郑州奇华顿化工产品有限公司，批号：20150527)；亲水性纳米硫化铜(PVP/CuS，课题组制备，批号：20180317)；三氯甲烷、甲醇等均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1DOX-PVP/CuS-Lip的制备 本实验采用薄膜分散法制备DOX-PVP/CuS-Lip纳米递药载体[7-8]，具体步骤如下：将DOX和PVP/CuS溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)(pH值=7.4)作为水相，备用。另精密称取豆磷脂和胆固醇置于茄形瓶中，加入三氯甲烷10 mL，使豆磷脂和胆固醇充分溶解。将茄形瓶置于40 ℃下进行旋转减压蒸发，直至其形成均匀的薄膜，加入制备好的水相溶液，待薄膜完全溶解后，探超5 min。即得DOX-PVP/CuS-Lip纳米混悬液。

2.2DOX-PVP/CuS-Lip的表征

2.2.1分散性及形态观察 分别取空白脂质体、含PVP/CuS的空白脂质体及DOX-PVP/CuS-Lip纳米混悬液适量，摄像记录外观状态及分散性，结果见图1。另取适量的空白脂质体及DOX-PVP/CuS-Lip纳米混悬液加超纯水稀释，滴至透射电镜TEM专用铜网，并用3%磷钨酸溶液染色，自然晾干后置于透射电镜下观察。结果见图2。

由图1可见，空白脂质体外观呈现为透明乳白色，PVP/CuS-Lip因铜离子的存在呈现蓝绿色，DOX-PVP/CuS-Lip为紫红色，三者均为分散性良好的纳米混悬液。由图2透射电镜照片可见，空白脂质体和DOX-PVP/CuS -Lip均呈类球形结构，大小较为均匀。

2.2.2粒径及电位 分别取空白脂质体、PVP/CuS-Lip及DOX-PVP /CuS-Lip适量，用超纯水稀释后，于电位及粒度分析仪中进行测定。结果见图3。

由图3可知，空白脂质体和DOX-PVP/CuS-Lip的平均粒径分别为131.6 nm(PDI=0.26)、和200.9 nm(PDI=0.43)，可见PVP/CuS及DOX加入后可导致脂质纳米载体的粒径增大，但仍约为200 nm，符合纳米制剂设计要求。空白脂质体及DOX-PVP/CuS -Lip的平均电位分别为(-15.9±0.8) mV和(-16.0±0.9) mV，说明两者均为较为稳定的体系。

A.空白脂质体；B.含PVP/CuS空白脂质体；C.DOX-PVP/CuS-Lip。

A.空白脂质体；B.DOX-PVP/CuS-Lip。

2.2.3包封率及载药量 精密量取DOX-PVP/CuS-Lip纳米混悬液0.2 mL，用甲醇破乳定容至5 mL，混合均匀后，在波长232 nm处测定吸光度，记为A总。精密量取DOX-PVP/CuS-Lip 1 mL置于超滤管中，在5000 r·min-1离心20 min。取滤液0.2 mL用超纯水定容至5 mL，混合均匀后，在232 nm处测定吸光度，记为A游。按照下列公式计算包封率和载药量[9]：包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%；载药量(%)=(W总-W游)/M总×100%。说明：W总表示加药的总质量；W游表示游离药物的质量；M总表示脂质体的总质量。

实验结果显示，DOX-PVP/CuS-Lip 中DOX的包封率和载药量分别为(91.0±2.0)%(n=3)和(11.02±0.2)%(n=3)，符合纳米制剂设计要求。

A～B.空白脂质体及DOX-PVP/CuS-Lip粒径分布图；C～D.空白脂质体及DOX-PVP/CuS-Lip电位分布图。

2.3光热转换实验 量取DOX-PVP/CuS-Lip纳米混悬液3 mL置于石英比色池，利用808 nm激光[2.5 W·(cm2)-1]照射，每30 s记录温度随时间的变化[10]。以超纯水做空白对照。然后以时间为横坐标，温度为纵坐标绘制光-热转换曲线，结果见图4。

图4 GA-DTX-PVP/CuS-Lip的光热转换曲线

由图4可见，DOX-PVP/CuS-Lip纳米混悬液在808 nm激光的照射下，温度随照射时间的延长而明显上升，照射6 min后温度能升高至约50 ℃。与此同时，超纯水组温度基本不变，说明DOX-PVP/CuS- Lip具有明显的光热转化效应。

2.4体外释放实验 采用透析法进行释放度实验，具体方法如下[11]：精密量取DOX溶液(1 mg·mL-1)2 mL或纳米混悬液置于透析袋(MWCO=30 kDa)，释放介质为pH值=7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)100 mL，设定恒温振荡器的温度为37 ℃，转速为100 r·min-1。分别于不同时间点取样4 mL，每次取样后补充同体积的空白介质。另同法考察DOX-PVP/CuS-Lip在45 ℃ 下的释放特性。应用溶出数据处理软件计算累积释放量。以时间为横坐标，累积释放百分率为纵坐标，绘制释药曲线，结果见图5。

A.37 ℃；B.DOX-PVP/CuS-Lip

图5A显示DOX溶液和DOX-PVP/CuS-Lip的释放特征存在明显差别，DOX溶液在约2 h时其释放率已达到100%，而DOX-PVP/CuS-Lip在8 h之后其释放率达到43.6%。由此可见，与DOX溶液比较，DOX-PVP/CuS-Lip具有明显的药物缓释作用。另由图5B可见，DOX-PVP/CuS-Lip在45 ℃条件下释药速度快于37 ℃下释放速度，如6 h 37 ℃和45 ℃条件下的累积释放率分别为39.1% 和63.7%，说明DOX-PVP/CuS-Lip体外释药具有温度依赖特征，结合局部外加热可加快制剂中的药物释放。

3 讨论

本课题采用薄膜分散法制备一种可用于肿瘤光热化联合治疗的DOX-PVP/CuS-Lip。该纳米载体的平均粒径为200.9 nm，DOX的包封率为91.0%，符合纳米制剂设计要求。波长808 nm近红外激光照射下，该纳米混悬液具有时间依赖型的光热转换特征。体外释放实验结果显示DOX-PVP/CuS-Lip具有明显的缓释作用和温度依赖性释药特征。本实验可为下一步进行DOX-PVP/CuS- Lip结合近红外激光进行体内外抗肿瘤活性研究奠定基础。