XRCC1 基因多态性与 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险的相关性研究

徐燕，蒋卫平，蒋慧玲，史杨，程慧斐，黄桂英，裴立红，周丽红

（丽水市中心医院，浙江 丽水 323000）

宫颈鳞状细胞癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，高危型人乳头瘤病毒感染是宫颈鳞状细胞癌发生的主要原因，同时宿主因素也起着重要作用，即不同的群体和个体对宫颈鳞状细胞癌的易感性存在差异。宫颈鳞状细胞癌的发病风险与某些基因单核苷酸多态性（SNP）相关[1-2]，X-射线交错互补修复基因 1（X-ray repair cross complementing group1，XRCC1）是一种重要的DNA修复基因，在DNA碱基切除修复途径（BER）中起重要作用[3-4]。以往对丽水地区妇女HPV感染流行病学调查显示，本地区患者最常见的高危型HPV为16、18、52和58型[5]。为此，作者在本地区进行XRCC1基因Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln单核苷酸多态性与 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌相关性研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年5月-2019年7月本院住院治疗的高危型 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌115例（宫颈鳞状细胞癌组），所有病例均经组织病理证实为宫颈鳞状细胞癌，经HPV分型检测为四个型别的单一或混合感染。同期选择本院体检的妇女143例（对照组），经HPV分型检测均为阴性，薄层液基细胞学检查（TCT）诊断为未见上皮内病变及恶性细胞（NILM）或良性反应性细胞改变（炎症）。宫颈鳞状细胞癌组年龄（52.8±9.2）岁，对照组年龄（53.1±8.9）岁，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。所有血液标本均成功进行了基因型分型，所有宫颈分泌物标本成功进行了HPV分型。宫颈鳞状细胞癌组和对照组XRCC1基因Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln三个多态性位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。受试者均为丽水籍并签署知情同意书，研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法 所有受试者均采集宫颈分泌物和静脉血，宫颈分泌物用专用细胞保存液保存，静脉血用EDTA-K2抗凝，受试标本的所有项目当天完成检测。

1.2.1 HPV分型检测 采用广州安必平医药科技股份有限公司产品，该试剂运用PCR-反向点杂交法，具体为针对人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区设计特异性引物和28型探针，并将特异性探针包被在尼龙膜上，再通过生物素标记的引物进行靶片断扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，通过杂交、洗膜，靶标中的型特异性片断会和特异性探针结合，最后进显色，并进行结果分析，从而检测出人乳头瘤病毒28种基因型DNA，包括：15种高危型别：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82（MM4）；3 种疑似高危型别：26、53、66；10 种低危型别：6、11、40、42、43、44、54、61、81（cp8304）、83（MM7）。

1.2.2 基因多态性检测 （1）核酸提取或纯化。采用江苏康为世纪生物科技有限公司产品，该试剂运用柱式提取法，具体为样本经蛋白酶K结合、裂解后，DNA特异性结合到Spin Columns柱上，污染物经离心丢弃，PCR抑制剂可通过两步有效的洗涤被完全去除，结合在离心柱上的核酸可用洗脱液洗脱，得到纯化的DNA，基因组DNA要求：经紫外分光光度计检测260/280≥1.7，260/230≥1.5，纯度5-10ng/μL。（2）XRCC1 多态性检测。采用美国 ABI公司产品，货号4351379，该试剂运用实时荧光PCR技术进行检测，针对XRCC1Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln三个位点设计引物和探针，在194-Trp、280-His、399-Gln的探针上标记FAM荧光素，在194-Arg、280-Arg、399-Arg的探针上标记 VIC 荧光素，通过实时荧光PCR分析其单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphims，SNP）。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0进行统计学分析，采用Haploview4.2进行Hardy-Weinberg平衡检验，计量资料比较采用t检验，两组间基因多态性分布比较采用χ2检验，以非条件Logistic回归方法计算相对风险度的比值比（OR）及其95%可信区间（CI）。

2 结果

2.1 SNP基因位点信息 作者通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1799782查询到XRCC1中的rs1799782基因多态性位点，580C>T表示在第580个碱基位置中编码精氨酸（Arg）的密码子CGG中的第一个碱基C突变成T形成编码色氨酸（Trp）的密码子TGG，编码的氨基酸位置为第194个，表示为Arg194Trp；通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs25489查询到XRCC1中的rs25489基因多态性位点，839G>A表示在第839个碱基位置中编码精氨酸（Arg）的密码子CGT中的第二个碱基G突变成A形成编码组氨酸（His）的密码子CAT，编码的氨基酸位置为第280个，表示为Arg280His；同理，通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs25487查询到XRCC1中的rs25487基因多态性位点，1196G>A表示第1196个碱基位置中编码精氨酸（Arg）的密码子CGG中的第二个碱基G突变成A形成编码谷氨酰胺（Gln）的密码子CAG，编码的氨基酸位置为第399个，表示为Arg399Gln。

2.2 HPV基因型分布 对照组143例HPV检测均为阴性，宫颈鳞状细胞癌组115例HPV检测均为阳性，基因型分布具体情况详见表1，其中31例同时感染其他型别的HPV。

表1 宫颈鳞状细胞癌组感染HPV基因型分布（n=115）

2.3 Hardy-Weinberg平衡分析 HWE软件检测结果显示，宫颈鳞状细胞癌组和对照组XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。详见表2-4。

表2 XRCC1-Arg194Trp基因型和等位基因分布频率

表3 XRCC1-Arg280His基因型和等位基因分布频率

表4 XRCC1-Arg399Gln基因型和等位基因分布频率

2.4 XRCC1基因型和等位基因频率分布 宫颈鳞状细胞癌组和对照组XRCC1-Arg194Trp和Arg399Gln基因型和等位基因频率分布差异有统计学意义（P＜0.05），宫颈鳞状细胞癌组和对照组XRCC1-Arg280His基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表 2-4。

2.5 XRCC1-Arg194Trp、Arg280His 和 Arg399Gln基因多态性与宫颈鳞状细胞癌的关系 XRCC1-Arg194Trp多态性位点中，携带Trp基因的个体HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险是 Arg个体的 1.793 倍（OR=1.793，95%CI=1.190～2.702，P＜0.05）；XRCC1-Arg399Gln 多态性位点中，携带 Gln 基因的个体 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险是Arg个体的1.668倍（OR=1.668，95%CI=1.126～2.472，P＜0.05）； 而 XRCC1-Arg280His 的多态性位点与 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险无关（OR=1.210，95%CI=0.753～1.945，P＞0.05）。 详见表 5。

表5 Logistic回归分析

3 讨论

XRCC1是主要的碱基切除修复基因，定位于人19号染色体的长臂 （19q13.2-13.3），大小为33kb，包含17个外显子[3]。XRCCI编码的蛋白质共有3个功能域，在DNA损伤修复过程中分别和不同的酶相互作用，参与DNA修复反应中的碱基切除修复和单链断裂修复[3-4]，对维持机体的遗传稳定性起着重要作用。XRCC1基因有60多个多态性位点，出现变异频率最高、研究最多的是保守序列区的3个多态性位点，分别是Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln[6]，此3个多态性位点已成为研究肿瘤易感性及肿瘤治疗反应性的遗传性分子指标。

本文首次以丽水地区人群为研究对象，探讨了XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和XRCC1-Arg399Gln基因多态性与宫颈鳞状细胞癌发生的关系，两组样本3个基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究对象具有群体代表性，分别代表了丽水地区健康妇女和感染 HPV（16、18、52、58）的宫颈鳞状细胞癌患者。结果显示，Arg194Trp多态性基因型在宫颈鳞状细胞癌组和对照组中的分布有显著性差异（P＜0.05），XRCC1 基因Arg194Trp 位点多态性使宫颈鳞状细胞癌发生的风险增加了1.793倍；而Arg280 His多态性与本地区宫颈鳞状细胞癌发病风险无关，XRCC1基因Arg399 Gln位点多态性使宫颈鳞状细胞癌发生的风险增加了1.668倍。

2007年浙江省妇女生殖健康实验室（杭州）Huang等[7]对539例宫颈鳞状细胞癌和473例宫颈上皮内瘤样病变（CIN）患者和800例正常女性进行了病例对照研究，发现与Arg399Arg（GG）相比，携带纯合子Gln399Gln（AA）基因型的受试者宫颈鳞状细胞癌风险显著增加2.32倍 （95%CI 1.47-3.65），杂合子 Arg399Gln（GA）基因型也与宫颈鳞状细胞癌风险显著增加相关；调整后的比值比（OR）为 1.58（95%CI 1.24-2.00）；同样，与 Arg194Arg（CC）野生型基因型相比，癌症的风险升高与Trp194Trp（TT）相关（OR：2.09，95%CI：1.45-3.02），而杂合子Arg194Trp（CT）的风险不相关，而 Arg280His多态性与宫颈鳞状细胞癌发病风险无关。针对XRCC1全部3个位点的基因多态性研究，本文结果与Zhang等[8]的研究结果较吻合。但查阅相关文献[8-12]，发现在世界范围内多地区中XRCC1基因多态性与宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系不明确，受民族或种族、地域等的影响，甚至可能得到相反的结果，故XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln多态性与宫颈鳞状细胞癌发病风险还有待于进一步的研究。

本文运用实时荧光PCR检测XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln多态性在丽水地区宫颈鳞状细胞癌患者与健康女性中的分布频率，首次阐明了本地区XRCC1多态性与宫颈鳞状细胞癌易感性之间的相关性，为进一步探讨宫颈鳞状细胞癌发病机制及研究宫颈鳞状细胞癌发病的地域性和种族性提供了可参考的分子遗传学依据，也为本地区宫颈鳞状细胞癌高危人群的早期预防和诊断提供新的思路。