人胃黏膜上皮细胞恶性转化模型建立的研究进展

王霞 董孟佳

[摘要] 我国是消化道肿瘤的高发地区，早诊断、早治疗是降低胃癌死亡率的重要手段。建立胃黏膜上皮细胞恶性转化模型是研究胃早期癌变的方法之一。目前常用的模型诱导剂有亚硝基胍、幽门螺杆菌、鹅去氧胆酸、赭曲霉毒素A、非编码转录调控基因表达等，但尚缺乏成熟公认的标准。本文就近年来文献发表的胃黏膜上皮细胞恶性转化模型作一综述，介绍各类模型制备方法、胃黏膜上皮细胞的形态变化、分子表达差异及其致病原理，为后续实验研究提供参考。

[关键词] 恶性转化;细胞模型;胃黏膜上皮细胞;癌前病变

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）03（b）-0036-04

[Abstract] China is a high incidence area of digestive tract tumors. Early diagnosis and early treatment are an important means to reduce the mortality of gastric cancer. The establishment of malignant transformation model of gastric mucosal epithelial cells is one of the important methods to study early gastric cancer. Currently model inducers include nitrosoguanidine， Helicobacter pylori， chenodeoxycholic acid， ochratoxin A， non-coding transcriptional regulatory gene expression and so on. There is no established standard for model development. This paper summarizes the malignant transformation model of gastric mucosa epithelial cells published in recent years， and introduces the methods of model preparation， related morphology， molecular expression difference and its pathogenic principle， so as to provide reference for further experimental research.

[Key words] Malignant transformation; Cell model; Gastric mucosal epithelial cells; Precancerous lesion

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率居世界恶性肿瘤的第四位，死亡率居恶性肿瘤的第三位[1-2]，严重威胁人类健康。目前被认可的胃癌发生进展模式是Correa等[3]提出正常胃黏膜-慢性浅表性胃炎（CSG）-慢性萎缩性胃炎（CAG）-胃黏膜肠上皮化生（IM）-异型增生（中度/重度）-胃癌（肠型）。从CAG到胃癌发生前统称为癌前病变（PLGC），此过程具有可控制、可逆转性，是胃癌防治的重要阶段。PLGC伴随胃黏膜上皮细胞向胃癌细胞的恶性转化，积极探索胃黏膜上皮细胞恶性转化的发病机制和治疗靶点，对于预防胃癌和降低胃癌发病率至关重要。细胞恶性转化指外源性因素对体外培养的细胞诱发的恶性表型改变，包括细胞形态、细胞增殖速度、生长特征（如锚着独立性生长或接触抑制消失等）、染色体畸变等方面的改变;转化的细胞接种在裸鼠皮下可形成肉眼可见的肿瘤。成瘤性是确定细胞发生恶性转化的可靠指标[4]。

目前关于胃黏膜上皮细胞恶性转化的研究并不多，其细胞模型的制作方法和标准也没有完全统一。探索胃黏膜上皮细胞恶性转化模型的标准制作方法对推动胃癌发生的相关机制和药物研究具有重要意义。常见的人胃黏膜上皮细胞（GES-1）具有正常人胃上皮细胞的特性和功能，可在体外稳定传代，且不具有锚着独立生长能力，接种裸鼠后6个月内不会成瘤。这些生物学特性使其成为了解正常胃黏膜上皮细胞离体特征及研究胃癌致病机制的良好选择[5]。现将常见的诱导GES-1恶性转化细胞模型的制作方法总结如下：

1 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导GES-1细胞恶性转化模型

MNNG诱导GES-1细胞恶性转化模型是研究最早且最多的实验方法。流行病学资料显示[6]，亚硝酰胺类化合物与人胃癌的发生密切相关，人体中亚硝基化合物主要通过亚硝胺腌制和加工的肉制品、其他食物、酒精饮料及体内的细菌还原硝酸盐而产生。MNNG是人工合成的亚硝基化合物，常作为典型的模式化学诱变剂和致癌剂，主要用于研究N-亚硝基类致癌物的致癌机制。研究显示，MNNG能诱导大鼠胃癌前病变的发生，是研究天然植物预防胃癌的最常用的致癌剂[7]。

研究发现[8]，经过MNNG处理后的GES-1细胞即MC细胞，随着传代的继续，细胞形态发生改变，从最初的梭形变成不规则形，细胞间接触紧密，呈“岛样”克隆生长。MNNG作用于GES-1細胞24 h后，MC细胞失去接触抑制能力，染色体畸变增多、细胞增殖率增加、获得软琼脂集落生成能力。提示MNNG使GES-1细胞发生质变，转化后的细胞具有肿瘤细胞的生物学特性[9]。张水莲[10]应用低剂量MNNG和同类药物N-甲基-N亚硝基脲（MNU）处理GES-1细胞，每周处理1次，连续处理4周后，细胞在正常培养基中继续传代，继续培养8周，随后进行细胞恶性表型检测以及裸鼠体内成瘤实验，结果显示MNNG和MNU能成功建立胃黏膜上皮细胞恶性转化模型。Yang等[11]在此基础上，将恶性转化成功的细胞多次稀释后挑取单个细胞形成克隆并扩大培养，制成单克隆细胞株，用于后续研究。

MNNG是一种不依赖于酶的代谢能够直接作用于胃肠道黏膜引起癌变的活性致癌剂，其可直接渗透胃幽门部和胃底部黏膜，诱发大鼠及犬实验性胃癌的发生。目前MNNG致癌机制尚不明确，可能与其促使胃黏膜发生上皮-间质转化、激活Wnt/β-catenin信号通路、促发胃黏膜上皮癌变的启动因子相关[12-13]。

2 幽门螺杆菌（Hp）诱导GES-1恶性转化

自从Marshall成功培养和分离出Hp以来，文献报道证实，Hp感染与胃癌癌前病变的发生密切相关[14-15]。世界卫生组织（WHO）将Hp列为第一类致癌危险因素。

刘琳娜等[16]按细胞∶细菌1∶50、1∶100、1∶200的比例分别加入GES-1细胞和高、低表达硫氧还蛋白1的Hp菌株共培养，发现随着Hp浓度增高、作用时间延长，GES-1细胞出现形态改变，细胞壁变得不光整，贴壁细胞数量减少，悬浮细胞增多，细胞的增殖活性逐渐受到抑制且呈观察时间和Hp浓度依赖性，细胞周期中进入S期的比例升高。邓志燕等[17]将浓度为1×109 CFU/mL的Hp菌液加入GES-1细胞中，按细菌∶细胞为200∶1共培养24 h，发现Hp感染后可显著抑制GES-1细胞增殖，诱导细胞凋亡，诱导胃黏膜上皮炎症细胞的浸润，释放白细胞介素（IL）-1β、IL-8等炎症介质。

Hp致病性主要依赖鞭毛、螺旋结构、脂多糖、细胞毒素相关蛋白和空泡毒素等多种致病因子，其致病机制复杂，目前发现Hp感染GES-1细胞后，可影响细胞自噬、多胺代谢异常，干扰细胞增殖、凋亡，促使肿瘤的发生[18-19]。

3 鹅去氧胆酸（CDCA）刺激GES-1细胞建立肠上皮化生（IM）模型

胆汁酸刺激是胃黏膜IM发生的重要内源性因素，CDCA是胆盐的原体，可模拟胆汁反流对胃黏膜的伤害刺激，用于胃黏膜上皮细胞IM模型的建立。李红[20]选用4种含有特定浓度的胆汁酸刺激GES-1细胞，最终确定CDCA刺激24 h效果最佳，并用Western blot和免疫荧光分别检测了肠上皮特异分子KLF4、VILLIN及MUC2的表达，证实其可作为胃黏膜IM的细胞模型。沈和德等[21]将CDCA溶解至无胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养液中，配成浓度为100 μmol/L的无血清培养基，加入到融合度80%的GES-1细胞中，24 h后换正常培养液继续培养，与对照组比较，CDX2抗体在CDCA诱导的GES-1细胞呈阳性表达，提示CDCA能诱导胃黏膜IM。刘洪等[8]采用不同浓度CDCA、MNNG刺激GES-1细胞，发现两者对GES-1细胞均有抑制作用，半数抑制浓度分别为0.42、173.79 μmol/L，镜下观察细胞形态均呈长梭形。提示MNNG、CDCA可通过下调胃特异性基因MUC1表达、上调肠特异性基因CDX2表达模拟胃黏膜肠化生细胞学改变，构建IM模型。

4 赭曲霉毒素A（OTA）诱导GES-1细胞恶性转化

OTA是一种真菌毒素，由曲霉菌和青霉菌株产生，广泛存在于粮食作物和咖啡、面包等食品中，流行病学调查发现[22]，河北部分地区出现胃癌高发与OTA广泛污染密切相关。2.5 μmol/L OTA作用于GES-1細胞，40代后细胞形态发生明显变化，细胞镜下呈多角形，大小不一，细胞间排列紧密，可见多核巨细胞，且呈团块状生长，排列紊乱，很多细胞周边多呈毛刺状，细胞迁移能力增强，可成功建立裸鼠成瘤模型。其作用机制可能与氧化应激，Wnt/β-catenin通路活化、诱导细胞周期蛋白表达相关[23-24]。崔晋峰等[25]发现OTA可以增加GES-1细胞微核的形成，诱导GES-1细胞染色体发生畸变。

5 非编码转录调控基因表达诱导GES-1细胞恶性转化

各类RNA间存在相互作用的网络，可以通过基因编辑技术，竞争性结合相应的miRNA，对该miRNA后续转录后调控作用发生有效控制，调控与癌症相关基因和通路的表达，促使细胞恶性转化。研究发现[26]，GES-1细胞经质粒转染后，通过影响miR-200a/b/c表达，出现GES-1细胞的恶性转化倾向，增加细胞的侵袭、迁移能力。

6 小结

N-亚硝基化合物、高糖类伴低蛋白食物、高盐饮食、霉变食物、Hp感染、维生素C缺乏、吸烟、年龄、胃癌家族史等均是胃癌发生的高危因素，这些危险因素也为建立胃癌实验模型的方法提供参考。

对于体外细胞恶性转化的鉴定目前尚无金标准。综合比较上述GES-1细胞恶性转化模型的建立方法，MNNG和Hp感染诱导GES-1细胞实现恶性转化的方法较为可靠，具有稳定性，可重复性。但Hp感染形成的模型细胞克隆形成率低于亲代对照细胞，不利于药物干预和研究，因此一般不将Hp作为唯一的致病因素来制作细胞恶性转化模型，更多的把Hp感染用作药物根除模型。CDCA诱导GES-1细胞实现恶性转化，只构建IM模型，缺少对萎缩性胃炎模型的研究，并且模型的检验标准是通过鉴定KLF4、VILLIN及MUC2等相关特异性分子，细胞形态学的研究不够详细，是否具有成瘤性仍需进一步检验。OTA、非编码转录调控基因表达诱导GES-1细胞恶性转化具有参考价值，但相关报道较少。此外，肿瘤坏死因子α、乙醇等对GES-1的影响，着重于黏膜损伤，和细胞恶性转化尚有一定距离。

综上所述，MNNG诱导GES-1细胞恶性转化，参考性强，是更容易成功的实验方法。该细胞模型的制作为胃癌癌前病变和相关药物的作用机制探索奠定了科学的基础。

[参考文献]

[1]  Bray F，Ferlay J，Soerjomataram I，et al. Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2]  Cai Z，Liu Q. Understanding the global cancer statistics 2018：implications for cancer control [J]. Sci China Life Sci，2019.

[3]  Correa P，Piazuelo MB，Camargo MC. Etiopathogenesis of gastric cancer [J]. Scand J Surg，2006，95（4）：218-224.

[4]  宋英利，席淑华.慢性砷染毒致细胞恶性转化机制的研究进展[J].环境与健康杂志，2013，30（10）：940-942.

[5]  柯杨，宁涛，王冰，等.人胃黏膜上皮细胞GES-1的建立及其生物学特性[J].中华肿瘤杂志，1994，16（1）：7-10.

[6]  徐淼，张倩男，杨辉，等.亚硝胺及前体化合物的致癌效应及其食用安全性研究进展[J].癌变·畸变·突变，2018， 30（1）：76-79.

[7]  Wang X，Liu H，Wang X，et al. Preventive Effect of Actinidia Valvata Dunn Extract on N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine-induced Gastrointestinal Cancer in Rats [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（15）：6363-6367.

[8]  刘洪，王珅，蒋凯林，等.MNNG、CDCA构建胃黏膜上皮细胞GES-1肠化生模型的可行性[J].山东医药，2018， 58（24）：1-4.

[9]  Sun ZQ，Yan HM，Jia B，et al. Morphology and function of the malignant transformation of GES-1 of immortalized cell induced by MNNG [J]. Chin J Modern Med，2012，22（22）：14-18.

[10]  张水莲.组蛋白修饰参与化学致癌剂MNNG和MNU诱发人胃黏膜上皮细胞恶性转化的机制研究[D].杭州：浙江大学，2016.

[11]  Yang Q，Xu E，Dai J，et al. miR-21 regulates N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine-induced gastric tumorigenesis by targeting FASLG and BTG2 [J]. Toxicol Lett，2014， 228（3）：147-156.

[12]  严展鹏，徐婷婷，安振涛，等.单功能烷化剂MNNG对人胃粘膜上皮GES-1细胞的损伤及其对Wnt/β-catenin信号通路的影响[J].生理学报，2018，70（3）：262-268.

[13]  蔡洁，王梅.胃上皮细胞经亚硝基化合物MNNG短时刺激后细胞形态、功能特性的变化[J].山东医药，2018， 58（18）：26-29.

[14]  怀千.幽门螺杆菌与胃癌致病机制及相关治疗方案的研究进展[J].蚌埠医学院学报，2019，44（6）：839-841.

[15]  单辉国，华付，陈婷，等.胃癌和癌前病变黏膜组织环氧化酶-2、表皮生长因子受体表达与幽门螺杆菌感染的相关性[J].湖南师范大学学报：医学版，2019，16（5）：67-70.

[16]  刘琳娜，丁士刚，石岩岩，等.表达硫氧还蛋白1的幽门螺杆菌对人胃上皮细胞株GES-1生长的影响[J].胃肠病学，2015，20（2）：93-96.

[17]  邓志燕，万强.黄芩苷对幽门螺杆菌诱导人胃黏膜上皮GES-1细胞损伤的保护作用及机制[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（19）：145-149.

[18]  熊励晶，童煜，谢晓丽，等.上调自噬对幽门螺杆菌感染后人胃上皮细胞GES-1的保护作用[J].中华消化病与影像杂志：电子版，2015，5（3）：35-38.

[19]  李论，陈鹏飞，朱俊垚，等.幽門螺杆菌相关胃癌与多胺代谢[J].生命的化学，2018，38（6）：787-791.

[20]  李红.miR-92a在胃黏膜肠上皮化生中调控CDX2的作用与机制研究[D].西安：第四军医大学，2014.

[21]  沈和德，褚明亮，易韦，等.胆汁酸诱导胃黏膜上皮细胞肠化生模型的建立与快速鉴定[J].甘肃医药，2017，36（6）：442-444.

[22]  李增宁，杨惠霞，张祥宏，等.河北省食管癌、胃癌高发区居民食用小麦赭曲霉素A污染情况分析[J].卫生研究，2006，6（35）：754-755.

[23]  贾欣.赭曲霉毒素A诱导人胃黏膜上皮细胞恶性转化及可能机制的研究[D].石家庄：河北医科大学，2014.

[24]  Jia X，Cui J，Meng X，et al. Malignant transformation of human gastric epithelium cells via reactive oxygen species production and Wnt/β-catenin pathway activation following 40-week exposure to ochratoxin A [J]. Cancer Lett，2016，372（1）：36-47.

[25]  崔晋峰，吴莎，刘静，等.赭曲霉毒素A对体外培养人胃黏膜上皮细胞染色体的损伤作用[J].肿瘤防治研究，2014，14（6）：541-544.

[26]  李素丽，周芳，张庆瑜，等.ZEB2基因3′UTR区转染对人胃黏膜上皮细胞GES-1增殖、侵袭、迁移的影响[J].天津医药，2014，42（5）：401-405，513.

（收稿日期：2019-09-19  本文编辑：刘明玉）