宫颈癌及癌前病变患者高危型HPV16感染与HLA—Ⅰ表达的关系

铁炜炜　葛芬芬

[摘要] 目的 探討宫颈癌及癌前病变患者高危型人乳头状瘤病毒16（HPV16）感染与人类白细胞抗原Ⅰ（HLA-Ⅰ）表达的关系。 方法 选取2014年4月～2016年4月我院行手术切除术或妇科检查的123例宫颈病变患者为研究对象，利用聚合酶链式反应（PCR）检测患者HPV阳性检出率，采用免疫组织化学S-P方法检测组织中HLA-Ⅰ蛋白表达水平，分析HLA-Ⅰ与宫颈癌及癌前病变患者高危型HPV16感染之间的关系。 结果 宫颈炎组织中HPV16阳性检出率为8.33%，明显低于宫颈内上皮瘤变（CIN）组织中HPV16阳性检出率（31.25%），差异有统计学意义（P<0.05），CIN组织中HPV16阳性检出率为31.25%，明显低于宫颈鳞癌（CSCC）组织中阳性检出率（79.10%）（P<0.05）；宫颈炎组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为95.83%，明显高于CIN组织阳性表达率（40.63%）（P<0.05），CIN组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为40.63%，明显高于CSCC组织中阳性表达率（19.40%）（P<0.05）；宫颈癌组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率与宫颈癌组织分化、临床分期以及淋巴结转移密切相关（P<0.05）；相关性分析结果显示，HPV16感染与HLA-Ⅰ蛋白表达呈显著负相关（r=-0.748，P<0.05）。 结论 HLA-Ⅰ表达及高危型HPV16感染与宫颈病变进展为宫颈癌密切相关，且HLA-Ⅰ蛋白表达与HPV16感染呈明显负相关。

[关键词] 宫颈癌；癌前病变；人乳头状瘤病毒16；人类白细胞抗原Ⅰ

[中图分类号] R737.34 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）12-0066-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between high-risk human papillomavirus 16（HPV16） infection and human leukocyte antigen Ⅰ（HLA-Ⅰ） expression in patients with cervical cancer and precancerous lesions. Methods A total of 123 patients with cervical lesions who underwent surgical resection or gynecological examination in our hospital from April 2014 to April 2016 were selected. The positive detection rate of HPV in patients was detected by polymerase chain reaction（PCR）. Immunohistochemistry S-P method was used to detect the expression of HLA-Ⅰprotein in tissues. And the relationship between HLA-Ⅰand HPV16 infection in patients with cervical cancer and precancerous lesions was analyzed. Results The positive detection rate of HPV16 in cervicitis tissues was 8.33%， which was significantly lower than that in cervical intraepithelial neoplasia（31.25%）， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The positive rate of HPV16 in CIN tissues（31.25%） was significantly lower than that in cervical squamous cell carcinoma（CSCC） tissues（79.10%） （P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in cervicitis tissue was 95.83%， which was significantly higher than that in CIN tissue （40.63%）（P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in CIN tissues （40.63%） was significantly higher than that in CSCC tissues（19.40%）（P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in cervical cancer was closely related to the differentiation， clinical stage and lymph node metastasis of cervical cancer tissues（P<0.05）. Correlation analysis showed that HPV16 infection was significantly negatively correlated with HLA-Ⅰprotein expression（r=-0.748， P<0.05）. Conclusion HLA-Ⅰ expression and high-risk HPV16 infection are closely related to the progression of cervical lesions to cervical cancer， and HLA-Ⅰprotein expression is negatively correlated with HPV16 infection.

[Key words] Cervical cancer； Precancerous lesions； Human papillomavirus 16； Human leukocyte antigenⅠ

宫颈癌是临床上女性最为常见的恶性肿瘤之一[1]，是全球范围内仅次于乳腺癌的女性第二大恶性肿瘤[2]。近年来，我国女性宫颈癌发病率呈现明显增长趋势，严重威胁了我国女性的身体健康及生命安全[3]。早期诊断并及时采取治疗措施对临床治疗宫颈癌具有重要意义，但目前由于宫颈癌发病机制尚未完全清楚，临床仍缺乏特效性诊断及治疗药物[4]。本研究旨在探讨宫颈癌及癌前病变患者高危型人乳头状瘤病毒16（human papillomavirus 16，HPV16）感染与人类白细胞抗原Ⅰ（human leukocyte antigen Ⅰ， HLA-Ⅰ）表达的关系，试图为宫颈癌早期诊断及阐明宫颈癌发病机制提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 臨床资料

选取2014年4月～2016年4月我院行手术切除术或妇科检查的123例宫颈病变患者为研究对象，所有患者临床资料齐全，且术前均未接受任何放化疗及激素治疗，未合并其他恶性肿瘤性疾病，年龄30～64岁，平均（41.57±5.32）岁，经病理学诊断，宫颈炎24例，宫颈内上皮瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）32例，宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）67例。本研究经本院伦理委员会批准进行，标本采集符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2主要试剂

氯仿、异丙醇、异戊醇、DNA纯化试剂盒、PCR试剂盒，均购于上海生工公司；S-P试剂盒、DAB显色试剂盒，均购于北京中杉金桥技术公司；鼠抗人HLA-Ⅰ单克隆抗体、广谱型二抗，购于美国Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取及HPV16阳性扩增 采用酚/氯仿抽提法提取新鲜标本组织总DNA，利用DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），以β-actin扩增阳性的DNA为模板进行HPV16片段扩增，所有引物由上海生工合成。具体操作严格按照PCR扩增试剂盒进行。采用琼脂糖凝胶电泳检测HPV16阳性情况，以452bp处出现扩增产物为HPV阳性，表示组织受HPV感染，若无则为阴性，表示无HPV感染。引物序列见表1。

1.3.2 免疫组化方法检测HLA-Ⅰ蛋白表达 所取标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制作厚度为4 μm的石蜡切片；采用免疫组化S-P（streptavidin-perosidase）方法，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，采用S-P试剂盒检测石蜡切片中HLA-Ⅰ表达，用已知阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，具体操作严格按照试剂盒使用说明进行。

1.4 S-P结果判定

以胞膜/胞酱染色呈现棕黄色颗粒为阳性表达。高倍镜下观察，以细胞染色强度与阳性细胞所占百分比评分乘积进行统计学分析，评分标准见表2[5]。以0～2分为阴性，标记为（-）；≥3分为阳性，标记为（+）。

1.5 统计学分析

采用统计学软件SPSS 19.0进行数据统计分析，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV16在不同宫颈病变组织中检出情况比较

宫颈炎组织中HPV16阳性检出率为8.33%，明显低于CIN组织中HPV阳性检出率（31.25%），差异有统计学意义（P<0.05），CIN组织中HPV阳性检出率为31.25%，明显低于CSCC组织中阳性检出率（79.10%）（P<0.05）。见表3。

2.2 HLA-Ⅰ蛋白在不同宫颈病变中的表达情况比较

宫颈炎组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为95.83%，明显高于CIN组织阳性表达率（40.63%）（P<0.05），CIN组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为40.63%，明显高于CSCC组织中阳性表达率（19.40%）（P<0.05）。见表4。

2.3 HLA-Ⅰ蛋白表达与宫颈癌临床病理特征之间的关系

宫颈癌组织中HLA-Ⅰ蛋白表达与患者年龄无相关性（P>0.05），宫颈癌低分化组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为27.91%，明显高于高分化组织阳性表达率（4.17%）（P<0.05）；宫颈癌临床分期Ⅰ期组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为40.00%，明显高于临床分期Ⅱ期、Ⅲ期阳性表达率（12.50%、6.67%）（P<0.05），临床分期Ⅱ期、Ⅲ期组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；宫颈癌无淋巴结转移组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为23.53%，明显高于有淋巴结转移组织阳性表达率（3.85%）（P<0.05）。见表5。

2.4 HPV16与HLA-Ⅰ的相关性

采用Spearman秩相关性分析结果可见，HPV16感染与HLA-Ⅰ蛋白表达呈显著负相关（r=-0.748，P<0.05），随HPV感染率升高，HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率呈明显下降趋势（P<0.05）。见图1。

3 讨论

宫颈癌在我国发病率位居女性生殖道恶性肿瘤之首。据世界卫生组织统计[6]，全球范围内，每年新增宫颈癌发病病例约50万例，而我国发病病例可达14万。我国宫颈癌发病年龄多见于35岁之后，以45～50岁为高发。临床研究证实[7]，早期宫颈癌患者治愈率明显高于晚期者，但由于现有诊断技术主要依赖于宫颈癌明显症状，大部分患者特征性临床症状出现较晚，严重影响了宫颈癌的早期预警及有效诊断，导致许多患者失去治疗最佳时机。目前，寻找新型早期诊断肿瘤标志物是宫颈癌治疗亟待解决的关键问题[8]。

目前，宫颈癌发病机制尚未完全清楚，普遍认为其发病取决于病毒、宿主以及环境协同等三方面因素，其中HPV持续性感染是宫颈癌发病最为重要的因素之一[9]。研究表明[10]，HPV持续性感染与宫颈疾病恶化密切相关，是反映宫颈病变严重程度的预测指标之一。HPV16是高危型HPV，可影响宿主细胞内基因表达以及正常蛋白质功能，从而改变细胞凋亡、DNA损伤修复以及抗原呈递等一系列重要机制，促进细胞增长繁殖，诱导细胞逃避免疫监视并诱发肿瘤[11]。大量研究表明[12-13]，高危型HPV16感染与宫颈癌发生发展密切相关。HLA-Ⅰ是由β2-MG轻链与糖蛋白重链组成的抗原分子，主要功能是将内源性抗原肽呈递到细胞表面[14]。当机体蛋白酶复合物降解细胞内病毒或者异常蛋白并且产生内源性抗原肽后，HLA-Ⅰ可以在抗原呈递元件协助下完成抗原肽组装负载以及提呈，实现CD8+CTL对病毒抗原或自身异常蛋白的识别以及免疫监视，从而起到调节适应性以及天然免疫应答的作用。研究表明[15]，HLA-Ⅰ类基因表达缺失与宫颈癌发病及发展密切相关，与宫颈癌患者生存率下降同样存在密切关系。因此，本研究旨在探讨宫颈癌及癌前病变患者高危型HPV16感染与HLA-Ⅰ表达的关系，为宫颈癌早期诊断及阐明宫颈癌发病机制提供一定理论依据。

本研究结果表明，宫颈炎组织中HPV16阳性检出率为8.33%，明显低于CIN组织中HPV16阳性检出率（31.25%），CIN组织中HPV16阳性检出率（31.25%）明显低于CSCC组织中阳性检出率（79.10%），说明随宫颈病变程度加深，HPV16感染率呈明显升高趋势，CSCC组织中感染率最高，HPV16感染是一个较长的过程，CIN发展成为CSCC期间，HPV16可协助肿瘤细胞影响机体基因表达，帮助肿瘤细胞逃避机体免疫监视以及清除，从而导致肿瘤扩散最终致癌；宫颈炎组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率为95.83%，明显高于CIN组织阳性表达率（40.63%），CIN组织中HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率（40.63%）明显高于CSCC组织中阳性表达率（19.40%），说明随着宫颈疾病恶性程度加深，HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率逐渐减少，严重宫颈疾病中存在HLA-Ⅰ表达缺陷，提示HLA-Ⅰ表达缺陷与宫颈癌发生有关，可作为宫颈癌前病变进展成为宫颈癌的肿瘤标记物。宫颈癌组织中HLA-Ⅰ蛋白表达与患者年龄无相关性，但随宫颈癌组织分化、临床分期以及淋巴结转移呈现明显下降趋势，说明随着宫颈癌病情加重，HLA-Ⅰ表达缺陷越为严重，HLA-Ⅰ表达缺陷导致肿瘤细胞更易于逃避免疫监视及清除，从而导致疾病进展及转移。相关性分析结果可见，HPV16感染与HLA-Ⅰ蛋白表达呈显著负相关，随HPV16感染率升高，HLA-Ⅰ蛋白阳性表达率呈明显下降趋势，即HLA-Ⅰ表达缺陷率明显升高，推测在宫颈疾病进展中，HPV16可整合到HLA-Ⅰ内，导致HLA-Ⅰ基因发生突变、缺失，导致肿瘤免疫逃逸并最终致癌，其具体作用机制值得进一步深入研究[16-20]，HLA-Ⅰ蛋白表达与宫颈癌临床病理特征关系方面，本研究结果显示HLA-Ⅰ蛋白表达与组织分化、临床分期以及淋巴结转移等因素存在显著相关性（P<0.05），这些因素是宫颈癌病变的高危因素，需要引起医务人员的高度重视。

本研究结果表明，HLA-Ⅰ表达及高危型HPV感染与宫颈病变进展为宫颈癌密切相关，推测HLA-Ⅰ表达缺陷可作为宫颈癌前病变进展为宫颈癌的重要预警标志，HLA-Ⅰ蛋白表达与HPV感染呈明显负相关，为阐明宫颈癌发病机制提供了一定依据，其具体相互作用机制，有待于进一步深入研究。

[参考文献]

[1] 赵同香，邓小虹，韩历丽. 宫颈癌筛查状况及评价指标研究进展[J]. 中华疾病控制杂志，2013，17（8）：715-717.

[2] Singh GK，Azuine RE，Siahpush M. Global inequalities in cervical cancer incidence and mortality are linked to deprivation，low socioeconomic status，and human development[J]. International Journal of MCH and AIDS（IJMA），2015，（1）：17-30.

[3] 王临虹，邱琇，郑睿敏，等. 我国宫颈癌流行病学状况及防治策略的回顾与展望[J]. 中国妇幼卫生杂志，2010， （3）：146-149.

[4] 甘露，魏明，寻倩，等. 宫颈癌的靶向药物治疗研究进展[J]. 国外医药（抗生素分册），2015，36（4）：154-156，183.

[5] 刘慧强. 我国宫颈癌流行病学特征和高危因素分析[J]. 中国妇幼保健，2016，（6）：1258-1260.

[6] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al. Cancer incidence and mortality worldwide：Sources，methods and major patterns in globocan 2012[J]. International Journal of Cancer，2015，136（5）： E359-E386.

[7] 万利杰，李小曼，王晓娟，等. 早期宫颈癌患者保留生育功能的治疗现状及研究进展[J]. 临床合理用药杂志，2016，9（3）：178-180.

[8] 孙瑶. 宫颈癌的靶向药物治疗研究进展[J]. 现代中西医结合杂志，2016，25（12）：1366-1368.

[9] 王楠，馬蓉，吴建中，等. 宫颈癌的发病机制、诊断及治疗进展[J]. 中国肿瘤外科杂志，2013，5（2）：121-124.

[10] Huh WK，Ault KA，Chelmow D，et al. Use of primary high-risk human papillomavirus testing for cervical cancer screening：Interim clinical guidance[J]. Gynecologic Oncology，2015，136（2）：178-182.

[11] 王莉. 端粒酶与HPV16/18 E6在宫颈病变中的关系及意义[D]. 广西医科大学，2014.

[12] 宋晓玲，蔡红兵. HPV16-E6-DNA对宫颈癌预后预测价值分析[J]. 中华肿瘤防治杂志，2015，22（6）：416-420.

[13] 于云英，张建海，邹存华，等. 宫颈腺癌组织HPV16/18-E7与Cyclin D1/pRb及ER表达临床意义分析[J]. 中华肿瘤防治杂志，2014，21（4）：256-259.

[14] 杨科，张冰，吴东，等. 人类白细胞抗原-Ⅰ类基因位点多态性与河南地区儿童急性淋巴细胞白血病相关性研究[J]. 中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（12）：1152-1154.

[15] 夏小艳，玛依努尔·尼亚孜. HPV及HLA与宫颈癌关系研究进展[J]. 现代生物医学进展，2010，10（8）：1566-1569.

[16] 苗小艳，孔繁斗，石敏，等. HPV16/18感染导致宫颈癌的分子机制研究[J]. 中国微生态学杂志，2015，27（10）：1152-1155.

[17] 朱永芹. 宫颈癌前病变及宫颈癌与高危型HPV16，18 DNA关系的探讨[J]. 国际医药卫生导报，2015，21（4）：480-481.

[18] 许晓燕，邢辉，兰艳丽，等. 葉酸水平及HPV16感染对妇女发生宫颈癌变的协同作用研究[J]. 实用癌症杂志， 2016， 31（6）：875-878.

[19] 李英. 宫颈癌相关基因表达与HPV感染的相关性研究[J]. 标记免疫分析与临床，2016，23（1）：50-53.

[20] 李艳，许玉雯. 高危型HPV感染与宫颈癌前病变及宫颈癌的相关性调查[J]. 中国医药指南，2016，14（26）：54.

（收稿日期：2017-02-15）