类叶升麻苷对APP/PS1双转基因小鼠行为学和激素变化的影响

陈嘉媛 高莉 罗嘉楠

[摘要] 目的 探討类叶升麻苷对APP/PS1双转基因小鼠行为学和激素变化的影响。 方法 选取C57 BL/6J小鼠10只作为对照（A组），选取健康APP/PS1双转基因小鼠50只，以体重随机分为B组（模型）、C组（多奈哌齐）、D组（类叶升麻苷低剂量）、E组（类叶升麻苷中剂量）、F组（类叶升麻苷高剂量），每组10只。连续给药120 d后，进行O迷宫实验，测定小鼠海马Aβ1-40含量和血清、垂体中各激素含量。 结果 与A组比较，B组在O迷宫中进入开臂距离、时间均显著缩短（P < 0.05）;与B组比较，D组在O迷宫中进入开臂距离、时间均显著延长（P < 0.01），E组在O迷宫中进入开臂距离延长（P < 0.05）。与A组比较，B组海马Aβ1-40含量显著升高（P < 0.01）;与B组比较，E组海马Aβ1-40含量显著降低（P < 0.01）。与A组比较，B组血清促肾上腺皮质激素含量显著升高（P < 0.05）;与B组比较，C组和F组血清促肾上腺皮质激素含量显著降低，F组血清皮质醇含量显著降低（P < 0.05）。与B组比较，D组垂体中促卵泡激素含量显著降低（P < 0.05）。与A组比较，B组促甲状腺激素含量显著降低（P < 0.05）;与B组比较，C组、E组及F组促甲状腺激素含量显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。与A组比较，B组垂体中生长激素含量显著降低（P < 0.05）;与B组比较，C组、E组及F组生长激素含量均显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 类叶升麻苷可通过调节Aβ1-40含量及激素分泌，改善APP/PS1双转基因小鼠焦虑情绪，保护脑神经回路，提高记忆能力。

[关键词] 类叶升麻苷;阿尔茨海默病;行为学;激素变化

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）03（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of acteoside on behavior and hormone changes of APP/PS1 double transgenic mice. Methods Ten mice of C57 BL/6J were selected as control （group A）. 50 healthy APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into group B （model）， group C （Donepezil）， group D （low dose of acteoside）， group E （medium dose of acteoside）， group F （high dose of acteoside）， 10 mice in each group. After 120 days of continuous administration， O maze test was carried out， and Aβ1-40 content in hippocampus of mice and the hormone content in serum and pituitary gland were determined. Results Compared with group A， the distance and time of arm opening in group B were significantly shortened （P < 0.05）; compared with group B， the distance and time of arm opening in group D were significantly lengthened （P < 0.01）， and the distance of arm opening in group E was lengthened （P < 0.05）. Compared with group A， the content of Aβ1-40 in group B increased significantly （P < 0.01）; compared with group B， the content of Aβ1-40 in group E decreased significantly （P < 0.01）. Compared with group A， the content of adrenocorticotropic hormone in group B was significantly increased （P < 0.05）; compared with group B， the content of adrenocorticotropic hormone in group C and group F was significantly decreased， and the content of cortisol in group F was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with group B， follicle-stimulating hormone content in pituitary gland of group D decreased significantly （P < 0.05）. Compared with group A， thyroid-stimulating hormone content of group B was significantly decreased （P < 0.05）; compared with group B， thyroid-stimulating hormone content of group C， group E and group F was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with group A， growth hormone content in pituitary of group B decreased significantly （P < 0.05）; compared with group B， growth hormone content of group C， group E and group F increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Acteoside can improve the anxiety emotion of APP/PS1 double transgenic mice， protect the cerebral neural circuit and improve the memory ability by regulating the content of Aβ1-40 and the hormone secretion.

[Key words] Acteoside; Alzheimer disease; Behavioristics; Hormonal change

阿尔茨海默病（AD）是频发于老年早期及老年期的一种相当复杂、严重并难以逆转的神经退行性疾病[1-2]，其临床研究结果指出，下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴激素与认知、衰老之间存在关联性，提示HPG轴激素的变化与AD的神经病理学有关[3]。此外，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴与AD之间也存在一定的关联。这一现象直观体现在AD女性患者多于男性上，女性对慢性压力的敏感性增加可能會增加AD的风险。压力诱导持续数年后易产生淀粉样斑块，应激激活HPA轴，从下丘脑和外周系统释放促肾上腺皮质激素释放激素（CORH），增加了Aβ、tau蛋白高磷酸化和血脑屏障的形成[4]。

类叶升麻苷具多种药理活性，如抗氧化损伤、神经保护、肝脏保护、免疫调节、抗AD活性等。新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学重点实验室（以下简称“本实验室”）前期研究表明，类叶升麻苷能够改善AD小鼠学习记忆障碍、焦虑情绪，以及抑制淀粉样蛋白聚集的作用[5-10]。本实验旨在研究类叶升麻苷对APP/PS1双转基因小鼠行为学和激素变化的影响，以期为类叶升麻苷可通过调节激素分泌改善APP/PS1双转基因小鼠焦虑情绪提出佐证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

O迷宫（XR-XZR209，上海欣软信息科技有限公司）;Luminex分析仪（Lumi-nex-200，USA，Ensprie）;类叶升麻苷（本实验室自制提取，纯度≥98%，201510）;多奈哌齐（北京偶合科技有限公司，纯度≥99%，150825）;氯化钠注射液（石家庄四药有限公司，1601093103）;乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司，T20111110）;酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海江莱生物有限公司，批号：JL11386）。

1.2 实验动物

实验组使用6月龄SPF级APP/PS1双转基因小鼠50只。对照组选用同月龄同背景的C57 BL/6J小鼠10只。出售单位：南京大学-南京生物医药研究院，许可证号：SCXK（苏）2015-0001，合格证号：201802110，由动物出售单位提供基因型鉴定报告。本实验遵循了单位、地区或国家所制订的有关实验动物保护和使用指南，并经新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所实验动物伦理委员会批准。

1.3 分组及给药

小鼠适应性饲养1周后，采用EXCEL软件以SOP随机分组法（根据体重和筑巢实验结果）分为A组（C57 BL/6J小鼠，对照组）、B组（模型）、C组（多奈哌齐，2 mg/kg）、D组（类叶升麻苷低剂量，45 mg/kg）、E组（类叶升麻苷中剂量，60 mg/kg）;F组（类叶升麻苷高剂量，90 mg/kg），各10只。连续给药120 d。

1.4 O迷宫

将小鼠放置在开、闭臂区间接点处，面向闭臂区间。迷宫设置选择重心跟踪法跟踪识别，识别算法中选择灰度法，调整灰度值。记录5 min内小鼠穿越开臂区间的次数和停留在开臂区间的时间。

1.5 测定小鼠海马中Aβ1-40含量

取处理好的海马样品上清，严格按照ELISA试剂盒说明书测试Aβ1-40的含量。

1.6 血清中促肾上腺皮质激素（ACTH）及皮质醇（CORT）含量测定

取处理好的血清样本待测。使用“方法分析缓冲液”配置抗体固定珠，用纯净水或去离子水配制质量控制，血浆基质和“方法洗涤缓冲液”，使用Luminex 200测定血清中ACTH、CORT含量。

1.7 垂体中促甲状腺激素（TSH）、促卵泡激素（FSH）及生长激素（GH）含量测定

取待测垂体，处理后用Luminnex 200测定TSH、FSH、GH的含量，具体检测步骤同“1.6”中血清ACTH、CORT含量的测定。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠在O迷宫中进入开臂距离及时间比较

与A组比较，B组在O迷宫中进入开臂距离、时间均显著缩短（P < 0.05）;与B组比较，D组在O迷宫中进入开臂距离、时间均显著延长（P < 0.01），E组在O迷宫中进入开臂距离延长（P < 0.05）。见图1。

2.2 各组小鼠海马Aβ1-40含量比较

与A组比较，B组海马Aβ1-40含量显著升高（P < 0.01）;与B组比较，E组海马Aβ1-40含量显著降低（P < 0.01）。见图2。

2.3 各组小鼠血清ACTH及CORT含量比较

与A组比较，B组血清ACTH含量显著升高（P < 0.05）;与B组比较，C组和F组血清ACTH含量显著降低，F组血清CORT含量显著降低（P < 0.05）。见图3。

2.4 各组小鼠垂体中FSH含量比较

与B组比较，D组垂体中FSH含量显著降低（P < 0.05）。见图4。

2.5 各组小鼠垂体中TSH含量比较

与A组比较，B组TSH含量显著降低（P < 0.05）;与B组比较，C组、E组及F组TSH含量显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。见图5。

2.6 各组小鼠垂体中GH含量比较

与A组比较，B组垂体中GH含量显著降低（P < 0.05）;与B组比较，C组、E组及F组GH含量均显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。见图6。

3 讨论

焦虑是AD的重要表现之一[11]。O迷宫可判断动物的焦虑状态[12]。本实验O迷宫结果提示类叶升麻苷可以缓解APP/PS1模型小鼠由于痴呆造成焦虑的情绪。Aβ为APP中较为重要的一个片段，现下大部分学者认为，AD发病过程中的关键环节是APP基因异常代谢产生Aβ沉淀[13-14]。本实验中ELISA数据提示类叶升麻苷可以降低APP/PS1小鼠海马中Aβ1-40的含量。

CORH在调节HPA中起着重要作用[15]。CORH对ACTH释放的作用被加压素强烈增强，当下丘脑室旁神经元被慢性激活时，加压素的共同分泌量会增加。ACTH的释放导致CORT的释放，随后，通过矿皮质激素和糖皮质激素受体，对海马体、垂体和下丘脑等施加负反馈[16-17]。此外，HPA轴与HPG轴之间存在密切的相互作用，兩者均与老年痴呆症密切相关[18]。

目前甲状腺功能异常明显影响到老年人认知功能障碍，其在神经系统发育、神经功能调节等方面的重要性也日益受到关注[19]。正常状况下，垂体分泌TSH，TSH则刺激甲状腺细胞分泌甲状腺素和三碘甲腺原氨酸，以保证HPT轴的稳定[20-21]。本实验中B组实验鼠体内TSH含量明显降低，打破了甲状腺激素分泌的稳定性，类叶升麻苷则能通过影响HPT轴有效改善甲状腺激素的分泌，从而达到防治老年痴呆的目的。

从本实验结果可以发现，类叶升麻苷不同剂量的药物对不同激素的影响也不尽相同，联系行为学数据可知，F组的类叶升麻苷对脑神经回路影响较大，且能通过影响激素达到这一目的，如HPG轴的变化，而D组对小鼠焦虑情绪的缓解有更大帮助。类叶升麻苷对于HPA轴、HPG轴与HPT轴中所含激素的分泌均有良好的改善效果，这无疑为类叶升麻苷在AD中的治疗研究打了一剂强心针。

综上所述，类叶升麻苷能缓解APP/PS1小鼠的躁狂情绪，降低APP/PS1小鼠海马中Aβ1-40的含量;可有效改善APP/PS1小鼠血液中HPA轴亢进的现象;能作用于HPG轴，抑制FSH的分泌;亦能作用于HPT轴，有效地升高TSH、GH。初步提示类叶升麻苷可通过改善焦虑情绪、影响激素变化等途径起到治防老年痴呆的作用，其作用机制有待于进一步的深入研究。

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（收稿日期：2019-09-24  本文编辑：李亚聪）