限域结晶法制备载β-胡萝卜素的氧化淀粉水凝胶球

白 杰，屈殷子，王珊珊，华 姗，朱雨婷，李 媛

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

近年来，食源性生物活性物质例如多酚、类胡萝卜素等，因具有抗氧化、抗癌、辅助降血糖、降血脂等功能受到越来越多的关注[1]。然而该类分子大多在水中溶解度极低，限制其在食品中的应用，同时在人体中的吸收率较低，影响其发挥健康功效。β-胡萝卜素是广泛存在于植物、藻类与真菌中的四萜类碳氢化合物，分子式为C40H56，是一种重要的天然食用色素，也可以用作营养强化剂[2]。β-胡萝卜素是VA的前体，一分子的β-胡萝卜素可以转化为两分子的VA，是人体VA的主要来源[3]。β-胡萝卜素能够清除体内单线态分子氧与过氧自由基，具有较高的抗氧化活性[4-5]，对癌症与心脑血管等疾病具有一定预防作用[6]。然而β-胡萝卜素对光、热、氧极为敏感，易发生降解、氧化、异构化、光敏化等反应，导致生物活性降低。另外β-胡萝卜素不溶于水，微溶于植物油，极大程度限制了β-胡萝卜素在食品中的应用[7]。为提高β-胡萝卜素的稳定性，扩大其应用范围，采用食品大分子运载体系对其进行增溶稳定成为近年来食品领域中的一个研究热点，目前用于包埋β-胡萝卜素的运载体系有乳液[8]、凝胶[9]、微胶囊[10]、纳米颗粒[11]和分子复合物[12]等。

淀粉因其来源广、成本低、生物相容性好等优势，被广泛应用于食品和生物医药领域，运载食品活性因子或药物分子至靶向部位，提高食品活性因子稳定性或药物输送效率[13]。天然淀粉由于缺乏可电离基团，在水中溶解度小，吸附率较低，限制其作为优质载体的制备材料。通过对淀粉改性的技术手段可以改进淀粉的理化特性，扩展其应用范围。常用的淀粉改性方法有酸解、酶解、氧化、酯化和交联等[14-15]。其中，氧化淀粉的应用较为广泛，通过引入羧基增强其电荷性和吸附性。2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基（2,2,6,6-tetramethylpiperidin yloxy，TEMPO）是一种能够在水环境中温和发生氧化反应的绿色环保催化剂，TEMPO/NaClO/NaBr氧化体系可以将多糖糖单元上的C6位羟基氧化为羧基，氧化度精确可控，如图1所示[16]。氧化淀粉可通过离子配位交联和共价交联等手段制得高荷载率的载体，同时具有缓控释、高吸附等效果[17]。研究者[18-20]使用三偏磷酸钠化学交联TEMPO氧化淀粉，形成一种新型的生物相容性良好的微凝胶体系，已被开发利用于花色苷和蛋白的递送。Zhao Luhai等[21]利用交联后的氧化淀粉制作一系列具有不同电荷密度和交联密度的微凝胶，并利用这种可生物降解的微凝胶系统控制溶菌酶的摄取和释放。Jiang Yumeng等[22]利用TEMPO氧化淀粉与靶向肽RGD结合，制备具有高度生物相容性的纳米载体靶向递送阿霉素至肿瘤组织，并在细胞和动物水平均显示增强的抗癌效果。

图 1 TEMPO催化氧化淀粉示意图Fig. 1 Schematic diagram of 2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy catalytic oxidation of starch

本研究提出利用限域结晶法制备一种能够运载β-胡萝卜素的氧化淀粉水凝胶微球。利用易挥发的有机溶剂（二氯甲烷）溶解β-胡萝卜素后作为内油相（O1）与氧化淀粉溶液（外水相，W）混合形成O1/W初乳，将所得初乳与FeSO4·7H2O溶液混合后滴加至外油相（O2），高速剪切后可形成O1/W/O2双重乳液，再向体系中通入氧气将Fe2＋氧化为Fe3＋，Fe3＋在水溶液（W）中与氧化淀粉上羧基交联，形成稳定的淀粉水凝胶球。淀粉水凝胶球中的内油相（O1）挥发后，留下β-胡萝卜素在淀粉球内结晶，即可实现β-胡萝卜素的高效运载。这种氧化淀粉水凝胶球可作为一种新型食品运载体系，具有较高的装载率，为提高生物活性物质的稳定性与生物利用率提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马铃薯淀粉（分析纯） 荷兰AVEBE公司；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基、三偏磷酸钠（均为分析纯）美国Sigma公司；β-胡萝卜素（分析纯） TCI（上海）化成工业发展有限公司；液体石蜡（化学纯） 西陇化工股份有限公司；FeSO4·7H2O（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；NaBr、NaBH4、正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯（均为分析纯） 北京化工厂有限责任公司。

1.2 仪器与设备

RTCB S25磁力搅拌器、T18 Basic高速剪切机德国IKA公司；UB100i显微镜 武汉奥浦信息技术有限公司；SP2共聚焦荧光显微镜 德国徕卡公司；JSM-6700扫描电子显微镜（scanning election microscope，SEM）日本电子公司；MASTERSIZER 3000激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TEMPO氧化淀粉的制备

参照De Nooy等[23]的方法进行。将8.1 g马铃薯淀粉缓慢溶解于500 mL沸水中，冰浴降温至8～10 ℃，将提前溶解好的TEMPO（0.648 g）溶液与NaBr（3.24 g）溶液加入上述溶液中，利用NaOH溶液调节pH 10。淀粉氧化度由加入0.5 mol/L NaOH与pH 10 NaClO4溶液的量控制，氧化度为90%的淀粉需要NaOH溶液的量为90 mL。氧化过程中，逐滴滴加0.5 mol/L NaOH与pH 10的NaClO4溶液，维持体系pH 10，温度为8～10 ℃。当加入规定量的NaOH后，加入10 mL的无水乙醇终止反应。5 min后加入NaBr，搅拌1 h。之后利用盐酸调节pH 3，搅拌1 h以除去多余的NaBr。最后将溶液pH值调节为中性。氧化反应结束后，在搅拌的状态下向体系中加入1.5 倍体积的乙醇以析出氧化淀粉，静置后抽滤得到氧化产物。利用无水乙醇洗涤3 次除去杂质。最后将所得产物放入通风橱内挥发乙醇后研磨保留。所得产物即为氧化度为90%的氧化淀粉（DO90）。

1.3.2 限域结晶法制备载β-胡萝卜素的淀粉水凝胶球

将一定量的β-胡萝卜素粉末溶于有机溶剂中作为分散相（O1）；氧化淀粉溶液作为连续相（W），加入质量分数3%的Tween 80。分散相与连续相按体积比1∶8混合后12 000 r/min剪切10 min，获得O/W初乳。准确称取一定量的交联剂FeSO4·7H2O，溶于pH 3的盐酸中，取50 µL FeSO4·7H2O溶液与200 µL上述O/W初乳混合后逐滴加入到溶有Span 80（0.75 g）的20 mL液体石蜡中。25 ℃条件下通入氧气交联10 min形成淀粉微球。10 000 r/min离心10 min获得微球沉淀后先用正己烷清洗3 次（5 000 r/min，3 min），再用甲醇清洗3 次，接着水洗3 次，除去外油相和残留反应试剂。制得的微球通入氮气干燥至少20 min后置于pH 3的HCl溶液中保存。

1.3.3 内油相（O1）有机溶剂的确定

β-胡萝卜素因其弱极性分子结构而不溶于水，能够溶于四氢呋喃、甲苯等有机溶剂，但这些溶剂因具有一定的毒性而不能应用于食品与药品中[24]。根据β-胡萝卜素的溶解度以及有机溶剂的挥发性挑选出石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯4 种试剂作为内油相（O1）制备淀粉球水凝胶球。利用显微镜观察制得的淀粉微球形态确定合适的内油相。

1.3.4 水相（W）氧化淀粉质量分数的确定

为探究淀粉质量分数对于形成载β-胡萝卜素氧化淀粉微球的影响，设置质量分数为1%、2%、3%、5%和10%氧化淀粉溶液作为水相制备O1/W初乳，利用显微镜与SEM观察其淀粉球形态及微观结构，通过不同氧化淀粉制备水凝胶球的稳定性确定氧化淀粉溶液的最佳质量分数。

1.3.5 交联剂FeSO4·7H2O用量的确定

交联剂FeSO4·7H2O溶于pH 3盐酸溶液中与O/W初乳混合后逐滴加入到液体石蜡中。体系中通入氧气将Fe2＋氧化为Fe3＋，25 ℃条件下Fe3＋与氧化淀粉上羧基交联10 min形成淀粉球。分别设置羧基与铁离子的物质的量比为9.17∶1、6.61∶1、4.58∶1、3.00∶1与2.29∶1，在相同质量分数氧化淀粉溶液的条件下比较不同交联剂用量对氧化淀粉水凝胶球的影响，并利用显微镜观察其形态。

1.3.6 氧化淀粉水凝胶微球的粒径分布

使用激光粒度仪进行测量。称取一定量氧化淀粉水凝胶微球分散于水中，质量浓度为0.05 mg/mL，测量前水浴超声2 min分散。测量温度为25 ℃，激光遮光度在2%～3%之间。

1.3.7 氧化淀粉水凝胶球的微观结构

利用SEM观察氧化淀粉球吸水膨胀后表面形态，用滴管吸取少量溶解于pH 3盐酸溶液中的微球，滴于云母片上，在空气中自然风干后喷金处理进行观察，加速电压为20 kV。

利用共聚焦荧光显微镜观察装载β-胡萝卜素的微球，由于β-胡萝卜素是天然荧光染料，可直接观察其荧光，样品置于共聚焦显微镜载玻片上，采用100 倍镜和具有488 nm激发的氩/氪激光进行观察。

1.3.8β-胡萝卜素装载率的测定

易挥发的有机溶剂（二氯甲烷）溶解定量β-胡萝卜素后作为内油相（O1）与氧化淀粉溶液（W）混合制成初乳，将初乳滴加到外油相（O2）制成O1/W/O2双重乳液，水相中Fe3＋与氧化淀粉中羧基交联后形成稳定的淀粉水凝胶球，离心获得微球。烘干后内油相（O1）挥发，留下β-胡萝卜素在淀粉球内结晶，称取装载β-胡萝卜素淀粉球的质量计算β-胡萝卜素的装载率。计算公式如下：

式中：A1为体系内β-胡萝卜素质量；A2为装载β-胡萝卜素淀粉微球质量。

1.4 数据分析

所有实验均进行3 次平行测定，数据分析采用Excel软件，结果表示为 ±s。图表分析采用Image J处理。

2 结果与分析

2.1 装载β-胡萝卜素的淀粉水凝胶球的制备

图 2 限域结晶法制备装载β-胡萝卜素的氧化淀粉水凝胶球示意图Fig. 2 Preparation of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene by confined crystallization

β-胡萝卜素在水溶液中溶解性极差，但易溶于氯仿、氯化烃等有机溶剂中。如图2所示，利用易挥发的有机溶剂如二氯甲烷等溶解β-胡萝卜素作为内油相（O1），与氧化淀粉溶液（W）混合后通过高速剪切制得O1/W初乳。在pH 3的盐酸溶液中，交联剂FeSO4·7H2O与O1/W初乳混合后逐滴加入到液体石蜡中制备成O1/W/O2乳液。体系中通入氧气，将Fe2＋氧化为Fe3＋进行交联，在水相中与氧化淀粉葡萄糖单元上的羧基配位交联，形成粒径为（15.2±2.1）µm的氧化淀粉水凝胶球，利用纯氧吹干水凝胶球使得二氯甲烷挥发，制得的微球置于pH 3的盐酸溶液中保存。淀粉水凝胶球中的内油相（O1）挥发后β-胡萝卜素留在淀粉球内结晶，即可实现β-胡萝卜素的装载。本研究利用FeSO4·7H2O作为氧化淀粉交联剂，体系中通入氧气将Fe2＋氧化为

Fe3＋与氧化淀粉上的羧基鳌合。根据Chen Xiaodong等[25]的研究，Fe3＋与羧基的配位模式主要有两种，单齿与双向桥接，双向桥接的比例更大，这两种交联方式使得氧化后的淀粉链形成致密的网状结构，获得更为稳定的水凝胶微粒运载体系。Wang Shanshan等[26]采用三偏磷酸钠交联TEMPO氧化淀粉形成凝胶用于吸附包含β-胡萝卜素的纳米乳液，结果表明可以有效提高β-胡萝卜素的生物活性，且可以在肠环境中特异性释放。相较于淀粉水凝胶球吸附乳液，直接利用限域的方式将β-胡萝卜素装载在氧化淀粉水凝胶球内使得装载率更高，可达到（29±3.2）%。利用氧化淀粉水凝胶微球在溶液中易于溶解，可有效提高β-胡萝卜素在溶液中的生物利用率和稳定性，并达到缓释目的。

2.2 有机溶剂的选择

图 3 包埋β-胡萝卜素的氧化淀粉微凝胶光学图像Fig. 3 Optical images of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene dissolved in petroleum ether, methylene chloride, hexaneor ethyl acetate

选取石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯4 种有机溶剂作为内油相（O1）制备水凝胶氧化淀粉球，并将淀粉球溶解在pH 3的盐酸溶液中置于显微镜中观察，结果如图3所示。使用乙酸乙酯、正己烷溶解β-胡萝卜素作为内油相（O1），得到的氧化淀粉水凝胶微球的内部乳液融合为整个乳滴，没有均匀粒径较小的乳滴存在，稳定性较差，导致装载率很低，所以不适合作为内油相。相比较而言，二氯甲烷和石油醚两种有机溶剂作内油相时，氧化淀粉水凝胶内部包埋β-胡萝卜素乳液滴分布均匀，较为稳定。因此二氯甲烷和石油醚是比较适合的内油相。此外，β-胡萝卜素在石油醚、二氯甲烷比在正己烷、乙酸乙酯中溶解度高，内油相中溶解度越高会使β-胡萝卜素的装载率越高。选取的4 种易挥发有机试剂，其中二氯甲烷的沸点是39.5 ℃，石油醚的沸程在40～80 ℃之间，相比之下二氯甲烷比石油醚更易挥发，易挥发的有机溶剂残留在氧化淀粉水凝胶微球中的可能

性更小。因而选择二氯甲烷作为溶解β-胡萝卜素的有机溶剂。为避免有机试剂残留影响载体的食品安全性，利用体系中通入纯氧干燥水凝胶淀粉球，既可以保证Fe3＋的稳定性，也可以充分挥发有机试剂，避免其残留。水凝胶球中内部包埋的有机试剂挥发使得β-胡萝卜素结晶在氧化淀粉球网络结构中，达到装载的目的。

2.3 氧化淀粉溶液质量分数的选择

图 4 不同氧化淀粉质量分数包埋β-胡萝卜素的氧化淀粉微凝胶光学图像Fig. 4 Optical images of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene with different concentrations of oxidized starch

如图4所示，当氧化淀粉溶液质量分数1%、2%时，聚合物松散无形，不能形成球形完整的氧化淀粉微球。这种现象表明氧化淀粉质量分数过低时，双重乳液不稳定，无法形成完整球形，内部初乳容易逃逸到外油相石蜡中，使得β-胡萝卜素的装载率降低。当质量分数大于3%时，即可形成球形完好的氧化淀粉水凝胶微球，且随着氧化淀粉质量分数增加，双重乳液相较稳定，铁交联氧化淀粉形成的微球球形完整。另外实验发现，氧化淀粉溶液质量分数越高，形成微球时间越短，交联反应越容易，形成的微球结构也越致密紧实。可见，氧化淀粉质量分数是形成稳定的氧化淀粉微球的重要因素。因此，10%作为最佳质量分数制备淀粉凝胶球。

2.4 交联剂使用量的选择

氧化淀粉水凝胶微球形成依赖于Fe3＋与氧化淀粉上羧基的配位交联，金属离子与糖之间的相互作用已经被广泛研究。例如，利用Fe3＋与蔗糖、葡聚糖或淀粉等相互作用研发新的补铁剂，研究表明糖类能够稳定三价铁氧化物，提高铁的利用率[27]。这种相互作用也广泛应用于藻酸盐水凝胶的形成，海藻酸是β-D-甘露糖醛酸（M）与α-L-古洛糖醛酸（G）通过1,4-糖苷键共价结合形成的，金属阳离子如Ca2＋、Sr2＋、Ba2＋等鳌合藻酸盐的β-羧酸盐基团形成离子型水凝胶[28]。其中在海藻酸盐分子链中的古洛糖醛酸区（G）更容易与Ca2＋相互作用，两条海藻酸盐分子链中的古洛糖醛酸块间结合Ca2＋后形成一个洞状亲水区域，还会与α-L-古洛糖醛酸区（G）片段上的O原子发生螯合作用形成“蛋盒”形稳定的结构[29]。但是Ca2＋与氧化淀粉中羧基间的作用与钙与海藻酸盐的作用不同，Ca2＋不能与氧化淀粉中的羧基形成“蛋盒”模型，导致Ca2＋交联的氧化淀粉微球并不稳定[30]。

图 5 不同羧基与铁物质的量比的氧化淀粉微胶囊包覆β-胡萝卜素光学图像Fig. 5 Optical images of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene with different molar ratios of carboxyl group to Fe3+

Fe3＋也可以交联形成稳定的藻酸盐水凝胶可应用于细胞培养，比Ca2＋交联的凝胶细胞黏附力更强。虽然Fe2＋也有能力交联海藻酸盐，但它是一种“软”金属阳离子，倾向于结合含有氮和硫的中性配体原子。相反，Fe3＋是“硬”金属阳离子的典型代表，优先结合氧原子以及带负电荷的配体如羧酸盐、酚盐或异羟肟酸酯组分[31]。本研究在体系中通入氧气将Fe2＋氧化为Fe3＋，利用Fe3＋与氧化淀粉上的羧基进行交联形成氧化淀粉水凝胶球。参考Chen Xiaodong等[25]对铁交联的魔芋多糖微球的研究中羧基与铁最佳物质的量比为8.61∶1。如图5所示，不同交联剂用量均可以形成一定量的微球。但是在羧基和FeSO4·7H2O物质的量比为9.17∶1与6.61∶1时制备的微球经冷冻干燥处理后微球发生破碎，说明交联度越小微球越脆弱。如图5E所示，当交联剂的量过高时，形成结构过于稳定的微球，在弱碱溶液中不易破损，无法释放装载的β-胡萝卜素。羧基与铁的物质的量比为4.58∶1时制得的氧化淀粉水凝胶球最为合适。

2.5 装载β-胡萝卜素的氧化淀粉水凝胶微球的表征

图 6 装载β-胡萝卜素的氧化淀粉微球SEM图Fig. 6 SEM photographs of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene

如图6所示，3%氧化淀粉形成的微球表面十分疏松，貌似“爆米花”状，具有较大的比表面积。而10%的氧化淀粉微球的表面有较多孔隙，这是微球在干燥时二氯甲烷挥发所导致的。另外，3%氧化淀粉制得的微球对β-胡萝卜素装载率为（14±2.4）%，而10%的氧化淀粉微球的装载率为（29±3.2）%，这是由于3%氧化淀粉制得的微球不如10%氧化淀粉制得的微球稳定，有机试剂挥发时对微球表面影响很大。同时，低质量分数的氧化淀粉交联速度较慢，需要更长的交联时间，内油相逃逸到外油相的可能性更大，降低了β-胡萝卜素的装载率。考虑到3%氧化淀粉制得的微球比表面积较大，结构疏松多孔，在吸附方面具有一定前景，可以吸附蛋白质、酶和多肽等生物活性物质等，继续发挥氧化淀粉水凝胶载体的优越性[32]。图6B显示，10%氧化淀粉制得的微球的粒径主要分布在5～10 µm之间，而马尔文粒径仪测得的粒径为（15.2±2.1）µm，这是因为淀粉亲水能力强，氧化淀粉水凝胶微球具有一定的吸水膨胀率，在水溶液中吸水膨胀，表现为更大的粒径。

2.6 β-胡萝卜素在氧化淀粉水凝胶微球的分布

通过限域结晶法成功制得氧化淀粉水凝胶微球，利用共聚焦荧光显微镜观察β-胡萝卜素在其中的分布，由于β-胡萝卜素是天然的荧光分子，可直接进行观察。由图7A所示，氧化水凝胶微球内部含有来自β-胡萝卜素的荧光，证明淀粉球对其装载能力。选取其中单个微球利用Image J分析荧光强度分布，如图7B所示，β-胡萝卜素均匀分布于淀粉水凝胶球内部。氧化淀粉水凝胶可以很好地分散在水中，因而可以有效提高β-胡萝卜素在水中的分散性，Kim等[33]将含有β-胡萝卜素的乙醇逐滴添加到淀粉糊中，依靠非特异性作用力将β-胡萝卜素包封在分散性良好的淀粉复合物中（粒径＜900 nm）。但是单纯的混合使得淀粉对β-胡萝卜素保护作用变弱，且保留率过低。

图 7 装载β-胡萝卜素的氧化淀粉微球共聚焦图Fig. 7 CLSM image and fluorescence intensity distribution of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene

Boon等[34]研究发现乳液的pH值对包埋活性物质的稳定性具有显著影响，在pH 4及以下的乳液中快速降解。在模拟胃环境中（pH＜2），纳米乳剂中的β-胡萝卜素降解更快[35]。相比较乳液体系而言，在低pH值条件时Fe3＋更为稳定地交联淀粉，使得氧化淀粉水凝胶微球在很大程度上不受胃酸的影响，保护微球中β-胡萝卜素的稳定性。当氧化淀粉水凝胶置于肠道碱性环境中，交联剂Fe3＋不稳定易形成沉淀，使得淀粉水凝胶球逐渐破裂释放出里面装载的β-胡萝卜素，达到活性化合物的肠道响应性释放的目的。Wang Shanshan等[36]研究表明氧化淀粉微球在肠环境中特异性释放β-胡萝卜素，且有效改善装载活性分子的热稳定性与贮藏稳定性。Shi Mengxuan等[37]同样利用Fe3＋交联氧化魔芋葡甘聚糖上的羧基，并利用壳聚糖作为涂层开发了负载多种抗氧化剂的pH值响应微球，应用于肠道特异性递送。综上所述，氧化淀粉水凝胶微球具有肠特异性释放β-胡萝卜素的潜力。

3 结 论

本研究通过限域结晶法，即利用可挥发的有机溶剂有效提高β-胡萝卜素的溶解度，将β-胡萝卜素限制于交联后的氧化淀粉球内以提高其装载率，制得粒径均匀的氧化淀粉水凝胶微球，能够提高β-胡萝卜素的稳定性、水溶解性与分散性，并在碱性环境中如肠环境中释放出装载的β-胡萝卜素，提高其生物利用率。因使用的有机溶剂易挥发，避免有机溶剂对食品安全性的影响。另外，探究不同有机溶剂、质量分数氧化淀粉溶液、交联剂使用量对形成氧化淀粉水凝胶的影响，选择制备氧化淀粉水凝胶的最佳条件。考虑到β-胡萝卜素的溶解度以及有机溶剂的挥发性，选择二氯甲烷为内油相（O1），氧化淀粉溶液质量分数为10%时，制得的淀粉球孔径较小，转载率高；当氧化淀粉上的羧基与交联剂Fe3＋的比例为4.58∶1时，制得的淀粉球稳定且易于在碱性环境中释放出装载的β-胡萝卜素。这种氧化淀粉水凝胶球可以进一步发挥淀粉载体价廉、无毒、水溶性好的优势，提高生物活性物质的稳定性与生物利用率，扩大脂溶性化合物的使用范围，可以为设计和开发新一代功能食品载体提供一定的理论依据。