蛋白质氧化对羊肉糜流变与凝胶特性的影响

张海璐，黄 翔，杨 燃，安凤平，艾明艳，黄 群,

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

蛋白质氧化是目前食品化学领域的研究热点之一，发生蛋白质氧化是肉制品加工过程中影响质量的重要因素，不仅会产生有害物质、降低肉制品的营养价值，还会改变肉的加工适应性[1-2]。蛋白质氧化主要是侧链氨基酸发生修饰，包括巯基氧化、芳香族羟基化和羰基形成[3]。自由基氧化导致肌原纤维蛋白发生交联和聚集，巯基氧化形成二硫键是肌原纤维蛋白交联方式的一种[4]。Zhou Feibai等[5]报道高水平氧化会诱导肌球蛋白聚集，结构变化导致肌原纤维蛋白凝胶化的改变，但低水平氧化没有显著变化。羟自由基氧化减弱凝胶的强度和持水能力，导致凝胶结构发生显著变化[6]。随着氧化程度的加深，羰基含量上升、肌肉微观结构被破坏，肌原纤维出现小片化，蛋白质的α-螺旋和β-折叠的部分结构遭到破坏，使其凝胶结构不稳定[7]。已有研究表明，氧化会对猪肉、鱼肉凝胶特性产生相关影响，导致持水性降低，凝胶强度下降等[1,3]。

羊肉肉质细嫩，蛋白质含量丰富，胆固醇含量较猪肉和牛肉少，富含丰富的微量元素，是一种受消费者喜爱的优质畜肉[8]。我国羊肉生产量、消费量较大，相关研究较多集中于保鲜技术、贮藏方式及发酵香肠等[9-12]。羊肉脂肪含量较高，蛋白质稳定性较差，易受加工、环境条件影响而发生氧化，目前关于氧化对羊肉蛋白结构与功能特性的影响鲜见报道。本研究应用羟自由基氧化体系，对羊后腿肉进行加速氧化，通过探究氧化时间对蛋白羰基和总巯基含量、凝胶特性和流变性质的影响规律，以期为羊肉的保鲜贮存与加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜羊后腿肉（8 月龄白山羊） 福州山野农贸市场；复合磷酸盐、大豆分离蛋白 广州嘉业食品配料有限公司；三氯化铁、抗坏血酸、过氧化氢、乙二胺四乙酸、尿素、盐酸胍、甘氨酸、三氯乙酸（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

全自动绞肉机 广州旭重食品机械有限公司；UV-1780紫外分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；TA.XT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems有限公司；TGL-16冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；MCR 301流变仪 奥地利安东帕（中国）有限公司；ADCI全自动色差仪 北京辰泰克仪器技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

新鲜羊后腿肉于0～4 ℃预冷1 h，剔除多余脂肪和结缔组织，将羊肉分割成均匀的肉块（1 cm×1 cm×1 cm），用流水进行清洗，纸巾吸干表面水分后放入4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 羊肉氧化处理

参考Li Shugang等[13]的肉氧化处理方法并适当修改。将预处理后的肉样均分为4 份，纸巾吸干肉块表面水分，置于Fenton氧化体系（1.0 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗坏血酸和10 mmol/L H2O2）中，肉样与氧化液比例为2∶1（g/mL）。密封避光于25 ℃恒温水浴中分别氧化1、3、5 h，获得不同氧化时间的氧化肉样；添加1.0 mmol/L乙二胺四乙酸溶液螯合氧化体系中Fe2＋，以终止反应。所得肉样置于4 ℃冰箱中2 h后备用。

1.3.3 肌原纤维蛋白提取

参照孙金辉等[14]的方法并稍作修改。称取适量经过氧化打浆后的羊肉糜，添加肉糜质量4 倍体积的0.05 mol/L Na2HPO4溶液（pH 7.0）缓冲溶液，高速匀浆1 min后，3 000×g冷冻离心15 min，取残渣再重复提取2 次。将残渣与4 倍体积的0.1 mol/L NaCl溶液混合，高速匀浆30 s后冷冻离心；所得残渣重复上述处理2 次，将所获残渣与4 倍体积的0.1 mol/L NaCl溶液混合，用蒸煮过的4 层纱布过滤；调整pH值为6.2后冷冻离心，所得蛋白膏于4 ℃冷藏，1 周内用完。

1.3.4 羰基含量测定

参照李德海等[15]的方法并稍作修改。将肌原纤维蛋白用0.4 mol/L NaCl磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）溶解，用2,4-二硝基苯肼反应测羰基值。

1.3.5 总巯基含量测定

参照Wang Yu等[16]的方法并稍作修改。用磷酸盐缓冲液溶解肌原纤维蛋白，用5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)测定吸光度，用13 600 L/（mol·cm）的摩尔消光系数计算总巯基含量。

1.3.6 羊肉糜的制备

处理后羊肉添加2.5%食盐、0.3%复合磷酸盐和2%大豆分离蛋白（以肉质量计），腌制12 h。将腌制好的羊肉打浆3 次（每次30 s）后，加入2%淀粉和20%冰水，继续打浆5 min。打浆后肉糜的一部分密封并于4 ℃冷藏，及时测定流变特性。使用灌肠器将另一部分肉糜灌入直径为22 mm的胶原蛋白肠衣中，制备好的肠放入高温蒸煮袋真空包装；75 ℃恒温水浴蒸煮40 min后，流水冷却至室温，置于4 ℃冰箱过夜，用于肉糜凝胶特性测定。

1.3.7 流变性质测定

参照翟小波[17]和Lee[18]等的方法并稍作修改。使用MCR型流变仪测定不同氧化时间处理的羊肉糜的热动态流变性。使用不锈钢圆形平板探头50 mm进行实验，将肉糜置于2 个平行平板之间，设定间隔为1 mm，设定应变为1%。

动态温度扫描：用硅油对暴露的肉糜进行密封，防止脱水。于20 ℃平衡10 min，以2 ℃/min的速率从20 ℃升温至75 ℃并保温10 min；再以恒定速率2 ℃/min从75 ℃降至20 ℃。固定频率为0.1 Hz，记录由于肉糜的刚性引起的任何储能模量（G′）变化。

动态频率扫描：0.1～20.0 Hz频率范围内扫描，记录在动态扫描范围内的G′和相位角（tanδ）。

1.3.8 质构分析和凝胶强度测定

参照王希希等[19]的方法并稍作修改。将制备好的肉糜肠切成表面平整、高1.5 cm的柱状，室温回温2 h。TPA模式分析质构，探头型号为P36，触发力5 g，5.00 mm/s的速度压缩50%，测定样品质构性质。Return To Start模式分析凝胶强度，探头型号为P0.5，触发力10 g，1.00 mm/s的速度压缩30%，获取数据速度为200 pps，对每种类型至少6 次重复测试。

1.3.9 持水性测定

持水性用离心法测量。将厚度为5 mm样品准确称质量记为m1，后用3 层滤纸包裹，转移到离心管中。4 ℃、5 000×g离心15 min，结束后对样品准确称质量记为m2，持水性计算如式（1）所示。对每种类型至少6 次重复测试。

1.3.10 色泽测定

用色差仪对5 mm的样品测定L*（亮度）值，a*（红度）值和b*（黄度）值，用式（2）计算白度W。对每种类型至少重复6 次测试。

1.4 数据处理

使用DPS 7.55软件分析，用One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，P＜0.05，差异显著，采用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 肌原纤维蛋白的羰基与总巯基变化

图 1 羰基和总巯基含量的变化Fig. 1 Changes in carbonyl and total sulfhydryl contents with oxidization time

由图1可知，随着氧化时间的延长，羰基含量显著增加（P＜0.05）。羰基为判定蛋白质氧化程度的最主要指标，羰基含量的增加可能是蛋白质的侧链或肽键受到—OH的攻击而引发[20]，α-氨基己二酸半醛和γ-谷氨酸半醛是形成的羰基化合物，是肉系统中蛋白质氧化的生物标志物，且在氧化过程中蛋白侧链或蛋白空间构象也可能发生改变[21]。此外，随着氧化时间的延长，总巯基含量显著下降（P＜0.05）。肌原纤维蛋白的总巯基在加工过程中容易发生不可逆的氧化状态，被氧化成多种氧化产物，使总巯基的含量显著降低[21]。且多种氧化产物对肌原纤维蛋白凝胶的形成和维持凝胶有一定影响[22]。

2.2 蛋白质氧化对羊肉糜流变学性质的影响

2.2.1 蛋白质氧化对羊肉糜G′的影响

G′代表随着材料的弹性组分变化而发生的变化趋势，主要反映其凝胶能力[23]。如图2A所示，随着频率的上升，羊肉糜的G′都存在不同程度的上升；在相同振荡频率下，随着氧化时间的延长，G′降低。其可能原因是氧化时间延长导致凝胶中肌原纤维蛋白的初级结构发生改变，分子间相互作用和交联改变，从而使得肉糜凝胶结构的聚集度降低，G′相应降低[24]。相位角为损耗模量（G′′）与G′的比值，说明凝胶三维网状结构的优劣[25]。如图2B所示，随着氧化时间的延长，tanδ值增加，表明长时间氧化会破坏肉糜凝胶的三维网络结构。

图 2 羊肉糜在频率改变过程中G’（A）和tanδ（B）的变化Fig. 2 Frequency-dependent curves of storage modulus G’ (A) and tanδ (B) for mutton batters with different oxidization times

2.2.2 温度对蛋白质氧化羊肉糜G′的影响

肉糜升温加热过程是肉糜受热变性展开、因凝聚作用而形成凝胶体的过程，属于不稳定的动态流变进程[26]。如图3A所示，随着氧化时间的延长，各组G′值的变化趋势基本趋同；在整个升温过程中，各实验组有相似的曲线，肉糜的动态流变曲线主要呈现出3 个阶段的变化。在20～47 ℃期间，G′呈现缓慢下降的趋势，主要原因可能是从低温开始升温的过程中肌原纤维蛋白发生溶解和溶胀[27]；在48～54 ℃期间G′快速下降，氧化时间越长G′值越低，有可能是温度的继续升高，导致蛋白质部分变性和网络结构解离，肌球蛋白尾部发生解离而使得流动性增加、凝胶网络结构遭到破坏[18]；在55～75 ℃期间G′随氧化时间的延长，处于迅速上升的阶段，凝胶强度持续增加，这说明继续加热使得具有黏性的肉糜溶胶转变成弹性凝胶[28]，且氧化5 h样品的最终G′值低于其他组，表明肉糜在长时间氧化过程中遭受破坏。

降温过程中体系进行重新快速的有序化，体系整体黏弹性增加。如图3B所示，整个降温过程中凝胶的G′值呈上升趋势。氧化5 h蛋白凝胶的G′值低于其他组。随着温度的降低，凝胶之间通过氢键等相互作用形成的三维网状结构更加稳固，从而G′升高[29]。

图 3 蛋白质氧化对羊肉糜在温度改变过程中G’的影响Fig. 3 Effect of protein oxidation on G’ of mutton batters during heating and cooling

2.3 蛋白质氧化对羊肉糜质构特性的影响

如表1所示，肉糜的硬度、弹性、凝聚性、胶黏性、咀嚼性、回复性均随着氧化时间的延长而下降。硬度和胶黏性在氧化时间3 h后显著降低，此前变化不显著。弹性和凝聚性随着氧化时间的延长而显著降低，回复性在氧化3 h时显著降低。弹性和回复性的降低说明通过压缩，肉糜恢复初始状态的能力下降，这与流变性质中肉糜的低G′相对应；凝聚性降低说明蛋白质氧化会导致凝胶内部结构易于破裂。有研究报道，氧化引起蛋白质分子构象发生改变和交联，影响三维网络结构的形成，导致肉糜凝胶特性劣变[30]；随着氧化程度的加剧，高浓度的氧化会降低肌原纤维蛋白的硬度和弹性，降低凝胶能力[29]。

表 1 蛋白质氧化对羊肉糜质构特性的影响Table 1 Effect of protein oxidation on textural properties of mutton batters

2.4 蛋白质氧化对羊肉糜凝胶强度的影响

图 4 蛋白质氧化对羊肉糜凝胶强度的影响Fig. 4 Effect of protein oxidation on gel strength of mutton batters

由图4可知，氧化时间与凝胶强度成负相关。与对照组相比，氧化1、3 h的凝胶强度显著下降（P＜0.05），5 h时趋于平稳。可能是由于氧化时间的延长，羊肉糜凝胶发生了部分蛋白与蛋白的交联。有研究表明，凝胶强度会随着蛋白质氧化程度的增加而改变，其原因可能与变性造成的蛋白质去折叠有关[3]；还可能是随着氧化程度的加深，蛋白质之间主要支撑凝胶强度的二硫键遭到破坏、数量大幅下降，从而使得凝胶强度降低[31]。

2.5 蛋白质氧化对羊肉糜持水性的影响

图 5 蛋白质氧化对羊肉糜持水性的影响Fig. 5 Effect of protein oxidation on water-holding capacity of mutton batters

持水性是肉糜凝胶优劣的重要评价指标，持水性越高，表明肉糜凝胶保持内部游离水分的能力越强。由图5可知，随着氧化时间的延长，羊肉糜凝胶的持水性呈下降趋势。氧化时间在3 h之前，肉糜的持水性显著降低（P＜0.05）；与氧化3 h样品相比，5 h样品的持水性变化不显著（P＞0.05）。可能是因为蛋白质氧化导致疏水基团间疏水相互作用增强，蛋白质解聚，降低肌原纤维蛋白凝胶的持水能力，且随氧化时间的延长，蛋白质水合能力逐渐下降[32]；同时蛋白质-蛋白质之间的相互作用增强，蛋白质与水分子之间的作用力减弱，使得肉糜的持水性下降[33]。Petracci等[34]的研究结果也表明肌原纤维蛋白分子之间能形成较理想的网状结构，但蛋白质氧化会破坏其结构稳定性，导致凝胶持水性下降。

2.6 蛋白质氧化对羊肉糜色泽的影响

表 2 蛋白质氧化对羊肉糜色泽的影响Table 2 Effect of protein oxidation on L*, a* and W values of mutton batters

色泽是影响肉制品食用品质、偏好和可接受的重要感官参数。由表2可知，随着氧化时间的延长，羊肉糜凝胶的L*值和W值呈显著下降趋势（P＜0.05），a*值呈下降趋势。Nyaisaba等[35]报道了羟自由基氧化处理的鳕鱼鱼糜凝胶的白度随着氧化程度增加而显著下降，与本研究结果吻合。蛋白凝胶白度能反映蛋白质的变性程度，羟自由基氧化产物与蛋白质的氨基酸发生相互反应可能致使蛋白质凝胶的白度值下降[36]。水分含量也是影响白度值的因素，氧化时间的延长使肉糜的持水性下降，从而影响肉糜凝胶的色泽[37]。

3 结 论

本实验研究了蛋白质氧化对羊肉糜流变性质和凝胶特性的影响，结果表明，随着氧化时间的延长，羊肉糜肌原纤维蛋白的羰基含量显著增加、总巯基含量显著降低，表明蛋白质氧化程度逐渐增加。随着氧化时间的延长，羊肉糜的G′值降低，tanδ值增加，蛋白质氧化能破坏肉糜的三维网状结构。升温过程中G′变化存在3 个阶段：20～45 ℃期间为第1阶段，G′处于缓慢下降状态；46～54 ℃期间为第2阶段，G′下降速率加快；55～75 ℃期间为第3阶段，G′处于迅速上升状态。降温过程中G′逐渐回升；氧化时间越少，G′终点越高。蛋白质氧化降低了羊肉糜的弹性、硬度、凝聚性、胶黏性、咀嚼性和回复性；蛋白质氧化时间延长，羊肉糜凝胶的持水性降低；随氧化程度加深，肌原纤维蛋白间二硫键减少，凝胶强度显著降低。随着氧化时间的延长，a*值呈下降趋势，L*值、W值显著降低。贮藏、加工中蛋白质氧化对羊肉及其制品品质的影响机理有待深入研究，以期为羊肉的贮运保鲜和羊肉制品的品质提升提供理论基础。