卵清分离蛋白-亚麻籽油高浓度乳液的制备及胶体性质表征

方艾虎，李凌云，杨宗蕴，徐幸莲，王越溪，王 鹏

（南京农业大学 肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京 210095）

蛋白质是参与、形成稳定水包油乳液的一类重要物质。乳液的内部结构关系到食品的保质期、质地和口感等[1]，而乳液中液滴的絮凝直接影响乳液结构，以及乳液中的界面稳定和液滴合并。影响液滴絮凝的一些变量包括油相体积分数、蛋白质/油的比率、平均粒径等[2]。在高浓度乳液体系中，液滴絮凝挤压作用和液滴间吸引力互相协调，引起的结构化使得乳液表现出塑性或黏弹性[3]。

亚麻籽油是常用的营养脂质来源，含有高达50%以上的α-亚麻酸[4]。此外，α-亚麻酸作为一种主要的n-3脂肪酸对大脑发育、视觉视力和免疫系统都起着重要的作用[5]。因此，近些年国内研究学者对亚麻籽油的加工利用进行了研究[6-7]。

国内[8]已经有部分学者对高浓度乳液内部的油滴絮凝与乳化剂[9-10]的交联进行研究，主要集中在低浓度乳液到高浓度乳液（油相质量分数为20%～60%）过程中乳液的流变性质与微观结构的变化，国外[11-12]部分学者也为乳液内部一定的多糖、蛋白质量分数造成乳液内部液滴絮凝对乳液的稳定性与性能的进行了研究。然而国内对较高油相质量分数的高浓度乳液的性质与结构研究较少。因此本研究以亚麻籽油作为分散相，卵清分离蛋白溶液作为连续相对高浓度乳液（油相质量分数为69%～85%）的结构性质进一步测定，包括流变性质、粒径分布、电导率以及激光共聚焦观察等，旨在为高浓度乳液的制备及其在酸奶、加工肉制品等中的应用提供实验依据，从而为高质量、高稳定性的乳状食品开发及卵清分离蛋白的新利用方式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵清分离蛋白粉（水分≤8.0%；蛋白质≥78.0%） 吉林金翼蛋品有限公司；亚麻籽油（压榨一级，2.456 L）锡林郭勒盟红井源有限责任公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 国药集团化学试剂有限公司；Nile Red和Nile Blue（硫酸耐尔蓝） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

MCR301高级旋转流变仪 奥地利Anton Paar公司；Mastersizer 3000激光粒度仪 英国Malvern公司；PD500-TP高性能分散匀浆机 英国Prima公司；激光共聚焦显微镜 德国徕卡公司；SensoDirect Con 200型电导率仪 德国Tintometer GmbH公司；MX-F固定式混匀仪 大龙兴创实验仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卵清分离蛋白-亚麻籽油高浓度乳液的制备

卵清分离蛋白粉（6%）与去离子水定量混合，通过混匀仪将蛋白粉均匀分散在去离子水中，静置1 h使其充分水合溶解；此溶液作为高浓度乳液的连续相。向连续相中分别加入质量分数为65%、70%、75%、80%、85%的亚麻籽油，用振荡器将两相均匀混合；用分散匀浆机以13 500 r/min的转速剪切2.5 min（每30 s间隔10 s）制成高浓度乳液[13]，所得乳液样品放入冰桶中迅速降至室温。

1.3.2 乳液表观黏度的测定[13]

使用MCR301高级旋转流变仪测定乳液的表观黏度。将乳液均匀涂布在50 mm的平板上，除去涂抹时产生的气泡，测试平板间的上下狭缝为0.5 mm，待稳定30 s，测试温度达到25 ℃后开始测试。总剪切时间330 s，记录在0.1～1 000 s-1剪切速率下卵清分离蛋白高浓度乳液的表观黏度变化。

1.3.3 乳液储能模量和损耗模量的测定

利用MCR301高级旋转流变仪测定乳液的储能模量G’和损耗模量G’’。测试平板的直径为50 mm，上下平板间距为1 mm，测试温度为25 ℃，应力为1%，角频率为1～100 rad/s，样品为在4 ℃冷库中放置12 h的卵清分离蛋白高浓度乳液[14]。

1.3.4 乳液的粒径分布

利用Mastersizer 3000激光粒度仪对高浓度乳液的粒径大小分布进行测定。取1 mL的蛋白乳液加入3 mL质量浓度为1 g/100 mL的SDS溶液中，用涡旋振荡器一挡涡旋溶液10 s后测定乳液粒径分布。在此测试中，分散剂为水且折射率为1.330；颗粒折射率参数为1.414；颗粒吸收率为0.001；颗粒的分析模式为球形[15-16]。

1.3.5 乳液电导率的测定

使用SensoDirect Con 200型电导率仪分别对亚麻籽油质量分数为65%、70%、75%、80%、85%的卵清分离蛋白高浓度乳液进行电导率的测定，记录不同油相质量分数下乳液电导率的变化情况[17]。

1.3.6 乳液的外观

使用SONY ILCE-6000L照相机对乳液进行拍照。

1.3.7 乳液的微观形态结构

采用共聚焦显微镜对乳液进行观察。蛋白乳液样品是用0.1%的Nile Bule A和0.02%的Nile Red进行染色，其中Nile Blue A对蛋白进行染色，Nile Red对油脂进行染色。染色时，每50 g乳液加入各1.2 mL的两种染色剂，染色过程需避光。染色后的乳液需避光在4 ℃冷库进行振荡过夜，以保证乳液的充分染色。将染色后的乳液取一部分小心加到载玻片上，并覆盖盖玻片。载玻片上的样品要涂抹均匀，除去不小心产生的气泡。将制好的样品放在载物台上，物镜转换为40×油镜，迅速在488 nm与633 nm激发光波长处采集图像，防止荧光焠灭[18]。得到的图片使用Image J V1.47进行处理，用Image J V1.47中的粒径分析功能进行测定，得到乳液油滴的费雷特直径与平均粒径[19]。

1.4 数据分析

实验重复3 次，结果以 ±s表示。采用Origin 8.0进行作图与分析，运用SAS V8软件中的ANOVA进行方差分析，比较样品数据间的显著性差异，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 油相质量分数对乳液表观黏度的影响

在高质量分数乳化体系中，由于油相质量分数很高，油滴间间距很小，会产生类似于胶体粒子的絮凝现象。但乳液液滴之间主要通过油滴界面层蛋白之间的氢键等作用，产生相互影响[20]。在较高的油相比例且均一分散时，强烈的絮凝作用下甚至可能呈现紧密压缩的三维网络结构[21]。但当剪切速率过大时，过高的能量输入会对已聚集液滴的扰动使得紧密压缩结构破坏，造成黏度降低[22]。

图 1 不同油相质量分数的高浓度乳液样品黏度分布Fig. 1 Viscosity distribution of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

如图1所示，在剪切速率0.1～1 000 s-1范围内，卵清分离蛋白高浓度乳液的表观黏度随剪切速率的增大而下降，即发生了剪切变稀现象。从图1可以发现，在亚麻籽油质量分数为65%、70%、75%时，乳液的黏度随着乳化物中亚麻籽油质量分数的提高而增加。一方面，随着亚麻籽油质量分数的增加，乳液由于相邻油滴的絮凝形成网络而具有更高的黏度；在较高的油质量分数下，油滴之间较大的接触表面积阻碍了剪切场中乳液的自由流动，增加了乳液黏度。另一方面，随着乳液中水分比例的减少，连续相中蛋白比例升高，乳液中蛋白质之间相互作用增强，这极大地提高了连续相的黏度，乳化油滴不能在高黏度网络中自由的移动，从而提高了乳液的黏度与稳定性[23-24]。实验参考Kato等[25]的方法，采用ANS荧光探针法测定蛋白表面疏水性。当蛋白质量浓度在1～6 g/100 mL范围内，连续相在激发波长390 nm、发射波长460 nm处的荧光强度从3 800增长到17 096（图略）。随着连续相中蛋白质量浓度增大，疏水基团暴露较多，连续相的疏水性增大，表面电荷数增多，乳液更加稳定，即连续相中的蛋白质分子之间的连接更加紧密，使得连续相黏度增大，乳液表观黏度增大[26]。在亚麻籽油质量分数为80%时，乳液连续相比例的进一步降低导致乳液中蛋白絮凝程度增加，油滴从其正常的球形变形挤压成为多边形，聚集乳液油滴，乳液呈现凝胶状态，其黏度降低。亚麻籽油质量分数为85%的乳液黏度远低于其他亚麻籽油的乳液黏度，这是由过量的卵清分离蛋白聚集，破坏了乳液的结构化，导致了空缺絮凝，从而大部分的油没有得到乳化造成的。

2.2 乳液的G’和G’’

应用G’和G’’进行不同油相质量分数高浓度乳液的变形流变特性研究。G’反映乳液的弹性性质，G’’反映乳液的黏性性质[27]。

图 2 不同油相质量分数的高浓度乳液样品G’和G”分布Fig. 2 Storage and loss modulus distribution of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

如图2所示，所有卵清分离蛋白乳液样品在本实验所考察的角频率范围内，G’和G’’在角频率达到20 rad/s后，随频率增加无显著变化。G’远高于G’’，表明这些油相质量分数的卵清分离蛋白高浓度乳液都呈现出弹性为主的凝胶性质[28]，可以认为图中所有的卵清分离蛋白高浓度乳液均形成凝胶状乳化物，对乳液中蛋白的疏水性进行测定时发现在亚麻籽油质量分数为65%、70%、75%时，高质量分数蛋白乳液稀释到同一质量分数后，乳液内蛋白荧光强度从6 055降低到2 813，乳液内蛋白疏水性随着油相质量分数的升高而降低，由于更多的蛋白质与油脂发生疏水作用结合，导致蛋白质三级结构的折叠，使疏水基团包埋[29]，因此表面疏水性下降，说明在高浓度乳液中，更多分散的油滴被包埋或整合进乳液凝胶网络中，使乳液的G’更高，乳液G’和G’’受到角频率的影响较小，总体趋势趋于平缓。

从图2可以看出，在添加65%、70%、75%、80%亚麻籽油的卵清分离蛋白高浓度乳液中，G’和G’’都得到了显著提高，这与图1中黏度变化趋势相符合。在65%、70%、75%、80%油相质量分数下，G’和G’’都随角频率的提高而略有提升；并且在同一频率下，乳液的G’和G’’随乳液中油相比例的提高而增大，这也表明油滴粒子在乳液中起到活性填充颗粒的作用[14]。

2.3 乳液的粒径分布

乳液中的油相经过高速剪切后，大的油滴被破碎成小的油滴，并被卵清分离蛋白包裹，使其分散在连续相之中。乳液中油滴的粒径大小是影响乳液稳定性及性质的一个重要指标，能直观地展示乳液中油滴的状态[30]。SDS是一种良好的抗絮凝剂，可将乳液中絮凝的油滴分散于连续液中的油滴的粒径越小，形成的油滴絮凝更加致密紧凑，乳液的物理稳定性越好。

图 3 油相质量分数对高浓度乳液样品粒径分布的影响Fig. 3 Effect of different oil phase concentrations on particle size distribution of high-concentration emulsions

如图3所示，亚麻籽油质量分数为65%、70%、75%、80%的高浓度乳液，其粒径随着油相比例的提高而减小，且都呈现出双峰分布。油滴粒径减小有利于乳液内部油滴粒子的稳态化，抵抗外界环境的变化而不至于聚集成大的油滴而分层。随着油相质量分数的增加，乳液油滴粒径减小的趋势与图2得到的乳液G’和G’’增加具有相关性，这可能是因为在本研究的小变形流变测试中，更小油滴的相互排斥或油滴的挤压导致胶体体系产生更高的应力[31]。

2.4 乳液的电导率分析

亚麻籽油是一种非极性溶剂，在20 ℃其电导率为0 μS/cm。高浓度乳液连续相用的去离子水的电导率大约为14.5 μS/cm。从图4可以看出，卵清分离蛋白高浓度乳液的电导率远高于亚麻籽油的电导率，这表明实验中的高浓度乳液是用亚麻籽油分散在蛋白水溶液中形成的。

图 4 油相质量分数对高浓度乳液样品电导率的影响Fig. 4 Effect of different oil phase concentrations on conductivity of high-concentration emulsions

从图4可以看出，在亚麻籽油质量分数为65%、70%、75%、80%时，高浓度乳液的电导率随乳液中亚麻籽油质量分数的增加而逐渐下降，这种下降可以认为一方面由于乳液中亚麻籽油质量分数升高，油滴粒径变小，表面面积增大，油滴之间的蛋白质薄膜越来越薄；另一方面由于亚麻籽油含量的增高，乳液中电荷流动移动难度增大[17,32]。当乳液中亚麻籽油质量分数达到85%时，乳液的电导率迅速下降到82.5 μS/cm，原因在于此时乳液中的连续相中蛋白质量分数太高，出现蛋白质聚集造成乳液中产生部分油包水与相分离现象。进一步实验观察发现，亚麻籽油质量分数为85%的乳液随着静置的时间延长，乳液的相分离加大，乳液底端的蛋白质絮状物增多，从而电导率值增大。

2.5 乳液的外观形态

乳化的剪切设置、蛋白质与油的比例，是制备细小液滴和比较窄的粒径分布的稳定乳液的重要影响因素[33]。如图5所示，在乳化条件一定时，不同的油相比例所得的乳液的形态是不同的。在图5A～D中，随着乳液中油相比例的升高，可以看到乳液从流态转变为固态的表观形态。这是由于当乳液油相质量分数较高时，覆盖了蛋白膜的油滴便变成活性填充物，均匀填充分散在连续相之中，从而增强了高浓度乳液的硬度；此时蛋白质的构象也可能发生变化，其疏水残基充分暴露，加强了蛋白质与油滴之间的相互作用[34]。

而如果乳液在乳化过程中存在过量未吸附的蛋白质，则可能形成聚集油滴。如图5E所示，此时乳液亚麻籽油质量分数为85%，随之乳液中水分比例变得很少，蛋白无法充分溶解造成乳液中出现中大量未参与结构化的蛋白，从而造成了空缺絮凝，大量蛋白聚集到一起与油相分离[35]。

图 5 不同油相质量分数的高浓度乳液样品表观形态Fig. 5 Apparent morphology of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

2.6 乳液的微观形态结构

图 6 乳液的共聚焦显微镜图Fig. 6 Confocal micrographs of emulsions with different oil phase concentrations

如图6所示，卵清分离蛋白高浓度乳液的微观结构与亚麻籽油的质量分数有关，随着油相比例的升高，乳液内油滴会发生聚集、絮凝，并有三维网状结构的形成，乳液油滴的粒径随着油相质量分数的增加而减小，并且油滴之间相互挤压。图6C中油滴由于挤压，呈现出多边形的形状，此时的乳液的弹性相应增加，与G’和G’’的测定结果相同；抵抗机械力和连续相分离的能力增强。而在图6D中，亚麻籽油质量分数达到80%，油滴粒径分布很不均匀，有很多1 μm左右的油滴凝絮在一起，也有部分未被乳化的油滴。在高浓度乳液中较小的油滴具有较高的界面区域，可以为蛋白质的吸附提供较多位点，从而增强油滴与基质的结合作用，提高乳液的稳定性与弹性[36]。此外，由于乳液连续相中蛋白质量分数太高（图6D），造成大量蛋白交联在一起因此有效地阻碍了油滴的聚结，交联聚合的蛋白质使得乳液呈现凝胶状[37]。

用Image J V1.47中的粒径分析功能对乳液的激光共聚焦图像进行分析，测定乳液油滴的费雷特直径。如表1所示，在亚麻籽油质量分数65%～80%范围内，乳液的平均粒径随油相质量分数的提高而减小，这与图3结果相符合。而当乳液中蛋白质与油脂比例改变，乳液内部的微结构会发生相应变化。随着油相质量分数的升高，乳液连续相中蛋白质的比例较高时，蛋白质会发生自聚集，部分絮凝状态的蛋白质聚集体未参与整体的结构化，以及起到固定和保持高浓度乳液特征性紧密压缩形态的作用[38]；与此同时，连续相中有效吸附蛋白的减少使油滴聚集形成大的油滴（图6D）。

表 1 不同油相质量分数下乳液的平均粒径Table 1 Average particle sizes of emulsions with different oil phase concentrations

3 结 论

本研究以卵清分离蛋白为连续相、亚麻籽油为分散相，通过高速剪切制备卵清分离蛋白-亚麻籽油高浓度乳液。亚麻籽油质量分数为65%～75%时，油相质量分数的提高可使卵清分离蛋白-亚麻籽油高浓度乳液中黏度、G’和G’’提高，乳液平均粒径减小以及电导率的下降，表明蛋白质界面膜变薄，乳液稳定性增强。油相质量分数为80%时，乳液黏度与平均粒径变小，但粒径分布变宽，蛋白交联聚结增加了乳液连续相的弹性，乳液向凝胶转化；与此同时，部分油滴的聚集形成了粒径较大的油滴，这也是乳液粒径分布变宽的原因。油相质量分数为85%时，乳液中黏度、G’和G’’都显著降低，乳液粒径显著变大；在乳液中存在大量未乳化的油滴，蛋白质无规则聚集与油形成松散絮状物，蛋白质与油相分离。由此可见，在高油相质量分数下制备卵清分离蛋白-亚麻籽油高浓度乳液具备很好的可行性，其良好的稳定性与高油相比例为今后高浓度乳液在食品领域中的应用提供依据和参考。