表面羧基化对聚合物微气泡性能的影响*

张宇璠韩莹瑶苏雄伟纪志峰左志段磊

表面羧基化对聚合物微气泡性能的影响*

张宇璠①韩莹瑶①苏雄伟①纪志峰①左志①段磊①

目的：探讨左旋聚乳酸（PLLA）及聚乙烯醇（PVA）为膜材的聚合物微气泡表面羧基化，对其形貌、粒径、稳定性及超声成像性能的影响。方法：首先对PVA膜材进行了羧基化修饰，通过红外光谱进行羧基化程度的表征。然后用羧基化前、后的PVA为原料分别制备了聚合物微气泡，光学显微镜及扫描电子显微镜（SEM）观察微气泡形貌，Zeta电位检测微气泡表面电荷特性，并对羧基化前后的微气泡进行体外超声成像实验。结果：羧基化不会显著影响微气泡的粒径，但会改变其表面结构，形成诸多凹陷；Zeta电位检测表明，羧基的引入使微气泡的表面电荷向负电性移动，微气泡羧基化之后能够显著增强超声成像效果，延长超声成像时间。结论：羧基的引入既由于静电斥力提高了微气泡的稳定性，又可赋予其耦联其他活性物质的能力，并可显著增强其超声成像效果。本研究为微气泡的生物医学应用打下了良好的基础。

微气泡；聚合物；超声成像

为了得到更准确、更及时、更丰富的医学影像学信息，需要合适的造影剂进行辅助[1]。在超声诊断成像中所用的造影剂主要是微气泡造影剂，其膜材种类、粒径大小、结构形貌、稳定性等性质对超声成像性能均会造成很大的影响[2-3]。

常用超声微气泡造影剂膜壳材料有白蛋质类、脂质体类及聚合物类等[4]。后者相比于前两者，具有较强的分子间作用力，制备的微气泡具有较厚的膜壳，可以抵抗外界环境中各因素的破坏，在体内循环持续时间长，因此被认为是更稳定的超声造影剂[5-7]。同时，较厚的膜壳也使得聚合物微气泡更容易包封或承载一些活性物质，如药物、抗体等，从而成为集诊断、靶向及治疗为一体、高效以及多模态、多功能方向的微气泡[8-15]。

表面羧基化是在一些粒子表面引入羧基，使其可以与很多基团，例如羟基、氨基等发生化学耦联，从而增大其应用空间，并提高其生物相容性及稳定性[16]。已有研究人员在磁性纳米粒子、微球、微囊等粒子表面进行羧基化修饰，取得了良好的效果[17-18]。对微气泡表面进行羧基化修饰的研究相对较少[19-20]。对羧基化之后微气泡的形貌结构、稳定性、超声成像效果进行深入探讨的文章仍然很少。

本论文以左旋聚乳酸（poly l-lactic acid，PLLA）及聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）为膜材的聚合物微气泡为研究对象，对其膜壳材料PVA进行了羧基化修饰（图1），对制得羧基化微气泡的物化性质进行表征，并进一步探究羧基化修饰对微气泡超声成像性能的影响，现具体报道如下。

图1 微气泡羧基化示意图

1 材料与方法

1.1 材料 PVA：分析纯，重均分子量Mw=31 000，德国西格玛奥德里奇中国有限公司；PLLA：分析纯，重均分子量Mw=30 000，济南健宝开元生物材料有限公司；高碘酸钠（NaIO4）：分析纯，广东省精细化学品工程技术研究开发中心；亚氯酸钠（NaClO2）：分析纯，上海晶纯试剂有限公司；吐温80：化学纯，海光铧科技有限公司；司班80：化学纯，山海久亿化学试剂有限公司；三氯甲烷（CHCl3）、冰醋酸（CH3COOH）、盐酸（HCl）均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 PVA羧基化 PVA单体中的1，2-乙二醇结构，可以被高碘酸或者高碘酸盐特异性断裂，进而氧化，在链的末端形成醛基，而当亚氯酸盐与醛基的摩尔比为4∶1时，有把其氧化成羧基的最高效率[15]。基于这个原理，可以对PVA进行羧基化修饰。具体步骤如下：将5 g PVA粉末加入100 mL二次水，溶胀过夜，再放入80 ℃水浴中加热，适当搅拌，至溶液完全澄清透明，配制出浓度为5%（w/v）的PVA水溶液。将溶液冷却至室温，用1 mol/L的盐酸调节pH值约为4，加入0.55 g高碘酸钠粉末，60 ℃水浴，搅拌反应约7 h。高碘酸钠反应完全后，将溶液迅速冷却至室温，醋酸调节pH值至3，再加入3.7 g亚氯酸钠粉末，静置5 h后，此时pH值约变为6，溶液由无色变为橙黄色，表明反应的进行。

1.2.2 微气泡的制备 分别以羧基化及未羧基化的PVA为原料，采用双重乳液/溶剂蒸发法制备微气泡[16-17]。具体过程如下：精确称取0.15 g PLLA加入10 mL的CHCl3中，再加入1 mL二次水以及3～4滴司班80试剂，用细胞粉碎仪（SONIFIER S250D，美国BRANSON公司数字型细胞破碎仪）以80 W的功率，25%的占空比乳化40 s，得到乳白色均匀液体。用滴管将其均匀缓慢加入5%（w/v）PVA水溶液30 mL中，同时用精密增力电动搅拌机（JJ-1，常州国华电器有限公司）以2000 r/min的速度均匀搅拌。再加入3～4滴吐温80试剂，搅拌4 h，静置并收集制得的微囊。并以3000 r/min离心10 min保留所得沉淀。加入二次水洗涤并以相同转速离心直至上清液无色透明，收集沉淀分别得到羧基化及未羧基化的聚合物微囊。在微囊中加入质量分数为5%的甘露醇，用冷冻干燥机（美国Labconco公司）进行冻干，干燥完成后以4 mL/min的速度充入氮气，即成为微气泡冻干粉样品。用上述方法分别制备了羧基化及未羧基化的微气泡。

1.2.3 表征 用红外光谱仪（Nicolet5700，美国Thermo Fisher公司）对羧基化前后的PVA进行红外吸收光谱（FTIR）检测；采用光学显微镜（BM1000，南京江南永新光学公司），扫描电镜（Ultra Plus，德国Carl Zeiss）进行微气泡形貌的研究；用Zeta电位检测仪（美国Brookhaven）进行微气泡表面电荷特性检测。

1.2.4 体外超声显影实验 体外超声显影实验系统由小动物超声影像系统（Vevo2100，加拿大VisualSonics公司）、自制的模拟人体声学特性的体模组成。体模的制备方法如下：将适量琼脂和二次水混合均匀并加热至沸，放入甘油。其中琼脂、甘油、二次水的比例为3∶4∶90。加热至沸后持续30 min，期间酌情加入二次水。去除上层泡沫，将高温液体倒入模具中，插入硅胶管。于室温下静置，待琼脂完全凝固，抽去硅胶管，留下模拟人体血管的空隙。将制备好的羧基化及未羧基化的微气泡冻干粉样品重悬于二次水中，调节其浓度均为1×109个/mL，取2 mL置于体模管道中，分别用小动物超声影像系统的25 MHz探头进行体外超声显影实验。当超声成像图片中的特定区域（region of interest，ROI）选定后，超声影像系统可自动计算该区域的平均灰度值，并实时给出平均灰度值随时间的变化曲线。

2 结果

2.1 羧基化的定性分析 羧基化修饰前、后PVA样品在1700 cm-1处和3500 cm-1处都有吸收峰，但是羧基化修饰的样品（红色曲线）明显比未羧基化修饰的样品（蓝色曲线）羰基吸收峰更明显，见图2。

图2 羧基化前后PVA的红外光谱图

2.2 羧基化对微气泡稳定性的影响 羧基化前后微气泡的分散稳定性发生了改变。羧基化修饰之后的微气泡有更好的分散性，不易团聚，可以更加均匀持久地分散于液态介质中，这有利于其体内外应用。为了进一步微气泡稳定性进行表征，测定了羧基化前后微气泡的Zeta电位，未羧基化微气泡的Zeta电位为（-20±2.09）mV，羧基化微气泡的Zeta电位为（-50±2.11）mV。

2.3 羧基化对微气泡微观形貌的影响 从光学显微镜及SEM的结果（图3）可以看出，羧基化前后的微气泡粒径分布并无明显差别，均在1～2 μm左右，羧基化修饰前后的微气泡均为球形，未羧基化微气泡表面光滑，而羧基化修饰的微气泡表面出现许多明显小凹陷。

图3 羧基化前后微气泡的光学显微镜及SEM结果

2.4 羧基化对微气泡超声成像性能的影响 与阴性对照组二次水相比，羧基化前后的微气泡均可以引起超声回波信号增强，使显影区域灰度值明显增加，而羧基化之后的微气泡具有更好的超声显影增强效果（图4a）。与二次水相比，两种微气泡均可使体模管道部位的超声图像亮度得到增强，随时间的推移，在超声场作用下，微气泡会逐渐发生团聚、破裂等现象，导致超声图像亮度逐渐减弱。其中，羧基化修饰后的微气泡具有更加优良的超声成像效果，能在较长的时间内使超声图像保持高灰度值（图4b）。

图4 羧基化前后微气泡的超声成像结果

3 讨论

对聚合物微气泡进行羧基化修饰就是将膜材PVA的羟基氧化成羧基。羧酸（RCOOH）的吸收峰有3000～3750 cm-1处氢氧键（O-H）和1600～1900 cm-1处碳氧双键（C=O）两个峰。找到并分析这两个峰就可实现对羧基化修饰过的微气泡进行定性分析。本研究结果显示羧基化修饰的样品明显比未羧基化修饰的样品羰基吸收峰更明显，表明PVA确实被羧基化。

Zeta电位是表征胶体分散系稳定性的重要指标，是对颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量。分子或分散粒子越小，Zeta电位的绝对值越高，说明其所带同种电荷越多，粒子间静电斥力越大，体系越稳定；反之，Zeta电位的绝对值越低，体系越倾向于凝结或凝聚，越不稳定。从表1中可以看出，虽然羧基化修饰前后的微气泡样品均带负电，但羧基化修饰之后的微气泡Zeta电位绝对值明显升高，这是因为羧基的修饰引入了更多的负电荷，因此提高了微气泡之间的静电斥力，很好地提高了微气泡在液态介质中的分散稳定性。

本研究中，羧基化前后的微气泡粒径分布并无明显差别，说明是否羧基化修饰对微气泡粒径影响不大。未羧基化微气泡表面光滑，而羧基化修饰的微气泡表面出现许多明显小凹陷，这可能是因为羧基化修饰改变了高分子聚合物的链段结构和状态，影响了PVA的物化性质，从而影响了微气泡表面的粘弹性，带来了微气泡表面形貌的改变。而微气泡粘弹性及形貌的变化必定会影响超声成像时的某些声学或动力学特性，从而可能引起超声成像结果的改变。

羧基化之后的微气泡具有更好的超声显影增强效果，羧基化修饰后的微气泡具有更加优良的超声成像效果，能在较长的时间内使超声图像保持高灰度值。这一方面可能是因为羧基化修饰改变了微气泡的表面形貌，使其表面出现很多凹陷（图3d），表面形貌的改变显然会影响微气泡在超声场中的回波特性，影响其声学或动力学特性，如改变微气泡缩放特性、非线性效应等从而使微气泡在超声场下的显影效果得到提高；另一方面，羧基化修饰提高了微气泡的分散稳定性，使其能均匀稳定的分布于液态介质中，从而增强了超声成像的时间稳定性。

综上所述，羧基化修饰会影响微气泡表面形貌，但不会改变其粒径分布。同时羧基化修饰使微气泡的Zeta电位绝对值增加，提高了其在液态介质中的分散稳定性。表面形貌和稳定性的改变影响了微气泡的声学性质，使得羧基化修饰过的微气泡的超声显影效果明显好于未羧基化修饰的微气泡，且显影持续时间延长，更有利于微气泡的体内应用。此外，羧基化修饰也为微气泡耦联其他物质提供了可能，如通过化学耦联抗体则可实现靶向分子显影；耦联药物或者基因，可用于疾病治疗，实现诊疗一体化。

[1] Tsao S K，Tsao J.P2B-1 estimation of tissue attenuation coefficients using contrast agent[C].IEEE Ultrasonics Symposium，2006，57（6）：1572-1575.

[2] Shan S F，Zhi Y R，Yuan L W，et al.Synthesis and application of hollow magnetic graphitic carbon microspheres with/without TiO2 nanoparticle layer on the surface[J].Chemical Communications，2010，46（34）：6276-6278.

[3]王翔.治疗超声联合耦连载MTX纳米粒微泡促药物跨血脑屏障转运的实验研究[D].重庆：第三军医大学，2013.

[4]何闻.表面装载超顺磁性氧化铁纳米颗粒的超声、磁共振双模式造影剂微气泡的研究[D].南京：东南大学，2011.

[5] Wheatleya M A，Forsberg F，Oum K，et al.Comparison of in vitro and in vivo acoustic response of a novel 50：50 PLGA contrast agent[J]. Ultrasonics，2006，44（4）：360-367.

[6] Straub J A，Chickering D E，Church C C，et al.Porous PLGA microparticles：AI-700，an intravenously administered ultrasound contrast agent for use in echocardiography[J].J Control Release，2005，108（1）：21-32.

[7] Chlon C，Guedon C，Verhaagen B，et al.Effect of molecular weight，crystallinity，and hydrophobicity on the acoustic activation of polymer-shelled ultrasound contrast agents[J].Biomacromolecules，2009，10（5）：1025-1031.

[8] Ferrara K，Pollard R，Borden M.Ultrasound microbubble contrast agents：fundamentals and application to gene and drug delivery[J].Ann Rev Biomed Eng，2007，9（9）：415-447.

[9] Hernot S，Klibanov A L.Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60（10）：1153-1166.

[10] Tinkov S，Bekeredjian R，Winter G，et al.Microbubbles as ultrasound triggered drug carriers[J].J Pharm Sci，2009，98（6）：1935-1961.

[11] Kooiman K，Vos H J，Versluis M，et al.Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery[J].Adv Drug Delivery Rev，2014，72（15）：28-48.

[12] Mulder W J，Koole R，Brandwijk R J，et al.Quantum dots with a paramagnetic coating as a bimodal molecular imaging probe[J].Nano Lett，2006，6（1）：1-6.

[13] Lee H，Li Z，Chen K，et al.PET/MRI dual-modality tumor imaging using arginine-glycine-aspartic（RGD）-conjugated radiolabeled iron oxide nanoparticles[J].J Nuc Medicine，2008，49（8）：1371-1379.

[14] Yang F，Li Y，Chen Z，et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticle-embedded encapsulated microbubbles as dual contrast agents of magnetic resonance and ultrasound imaging[J].Biomaterials，2009，30（23-24）：3882-3890.

[15]孙阳，王志刚，郑元义，等.多功能超声造影剂体外超声-磁共振双模态显像及增效高强度聚焦超声的实验研究[J].中华超声影像学杂志，2012，10（7）：67-69.

[16]杜鹏飞，许晓曦，金茂俊，等.羧基化Fe3O4磁性纳米微球的制备及表征[J].材料导报，2014，28（2）：42-45.

[17] Ma L，Sun Y，Kang X，et al.Development of nanobody-based flow injection chemiluminescence immunoassay for sensitive detection of human prealbumin[J].Biosensors & Bioelectronics，2014，61（6）：165-171.

[18]袁航.羧基功能化超顺磁性复合粒子的制备及其在免疫层析中的应用研究[D].长春：吉林大学，2010.

[19] He W，Yang F，Wu Y H，et al.Microbubbles with surface coated by super paramagnetic iron oxide nanoparticles[J].Mater Lett，2012，68（12）：64-67.

[20] Duan L，Yang F，Song L，et al.Controlled assembly of magnetic nanoparticles on microbubbles for multimodal imaging[J].Soft Matter，2015，11（27）：5492-5500.

Influence of Carboxyl Modification on the Surface of Polymer Microbubbles

ZHANG Yu-fan，HAN Yingyao，SU Xiong-wei，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（33）：007-010

Objective：To explore the influence of carboxylation on the surface of polymer MBs which made up of poly l-lactic acid and polyvinyl alcohol（PVA）on the morphology，size，stability and ultrasound imaging.Method：Firstly，the PVA was modified by carboxyl and the degree of PVA carboxylation was characterized by infrared spectroscopy.The polymer MBs were prepared by using PVA before and after carboxylation.The morphology of MBs were observed by optical microscope and scanning electron microscope.The unique electric charge characteristics of MBs surface were detected by Zeta potential detection.Finally，the ultrasound imaging experiments in vitro with MBs were performed before and after carboxyl.Result：Carboxylation didn’t affect particle size but affect morphology signally and changed the structure on the surface such as the formulation of hollows.Zeta potential detection indicated carboxylation made the surface charge of MBs move to electronegative place.Carboxylation could signally enhance the effect and extend the time of ultrasonic imaging after carboxyl.Conclusion:The introduction of carboxyl give MBs the ability of coupling other active substances as well as enhancing the stability of MBs because of electrostatic repulsion.It can also signally enhance the effect of ultrasonic imaging.This study lay a good foundation for the biomedical application of MBs.

Microbubble；Polymer；Ultrasound imaging

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.33.003

2015-09-05） （本文编辑：王利）

国家自然科学基金青年基金支持（61401217）；

江苏省大学生创新训练基金项目支持（201510312046Y）

①南京医科大学 江苏 南京 210029

段磊

First-author’s address：Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China