曲酸、抗坏血酸及柠檬酸对鲜切苹果褐变的影响

张婷婷 蒲云峰 王 雷 叶兴乾 刘东红，2*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310058 2 浙江大学馥莉食品研究院 杭州310058）

随着现代生活水平的提高，消费者在意识到合理健康饮食重要性的同时，更倾向一种便捷的饮食方式。鲜切水果满足了上述两个条件，受到越来越多的消费者欢迎，其行业经济重要性也日益显著[1]。作为最常见的水果，苹果含有大量生物活性分子，例如具有强抗氧化能力，抗炎和抗肿瘤特性的酚类化合物[2]。然而，食品加工企业现在面临的主要挑战是鲜切水果表面的酶促褐变，组织软化，营养价值的流失等问题，而对鲜切苹果来说，褐变是影响其货架期的主要原因[3]。鲜切苹果的传统保鲜方式包括物理、化学以及生物保鲜[4]。国内外鲜切苹果的化学保鲜研究报道很多，包括抗坏血酸[3]、柠檬酸[5-7]、D-异抗坏血酸钠[6-7]、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）[7]以及有机酸结合其它保鲜方法[8-10]对鲜切苹果酶促褐变的抑制。

曲酸是微生物的一种弱酸性代谢物，在食品生产中被用作抗氧化剂，通过螯合酶结构中的铜离子，保持食物色泽，并能够抑制黑色素形成的必需酶--酪氨酸酶[11]。何世微等[12]研究曲酸对菠萝蜜多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用效果，发现曲酸对菠萝蜜多酚氧化酶酶活的抑制作用较强且抑菌效果较好；孙蕊等[13]在0，4 ℃的条件下，研究不同浓度曲酸对鲜切山药色泽及相关生理变化的影响，发现0.1%，0.3%或0.5%曲酸均不同程度地缓解褐变，抑制多酚氧化酶酶活。然而，在比较曲酸与其它不同有机酸对鲜切苹果褐变抑制效果方面却鲜有研究报道。

本试验在同一浓度条件下比较曲酸、抗坏血酸及柠檬酸这3 种有机酸对鲜切苹果褐变方面的影响。根据综合分析，确定3 种物质中抑制褐变效果最佳的有机酸，为今后鲜切果蔬保鲜方面提供理论依据和试验指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择相同成熟度的富士苹果，表面无明显病虫害以及外观损伤，大小均匀、新鲜；330 mL 长方形保鲜盒（PP 食品级）。

无水柠檬酸（食用级）；曲酸、抗坏血酸（＞99.0%）、交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP，USP 级）、2，6-二氯靛酚钠盐水合物 （＞95.0%）、Triton X-100（生化级试剂）、聚乙二醇6000，购于阿拉丁；福林酚试剂（生化试剂）、三水合乙酸钠（分析纯）、二水合草酸（优级纯）、邻苯二酚（化学纯）、无水碳酸钠（分析纯）。

1.2 仪器与设备

超声波清洗装置（50 Hz，功率240 W），深圳市吉利特超声洗净设备有限公司；TA.XT2i 质构仪，北京微讯超技仪器技术有限公司；HC600 电子天平 （0.01 g），慈溪市华徐衡器实业有限公司；UV-2550 紫外分光光度计，日本岛津公司；Color-Flex EZ 色差仪，鼎韵中国公司；Waters e2695，沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 试验方法

苹果用纯净水洗净，去核，切成0.5 cm 厚的三角片状，分别在1%的曲酸、抗坏血酸以及柠檬酸中浸泡3 min 后，取出沥干，再装入保鲜盒，4℃贮藏。

1.3.1 硬度的测定 用TA.XT2i 质构仪测定果实硬度，探头直径5 mm。

1.3.2 色泽的测定 采用色差仪测定样品的L*、a*、b*值，然后计算褐变指数（BI）[14]：

式中：x=（a*+1.75L*）/（5.645L*+a*-3.012b*）

1.3.3 总酚含量的测定[15]称取5 g 果肉与20 mL 甲醇匀浆，定容至50 mL，然后超声30 min，离心备用。

在15 mL 试管中，先加0.6 mL 提取液，然后加1 mL 福林酚试剂，混匀静止5 min 后，再加3 mL 0.1 mol/L 碳酸钠和5 mL 蒸馏水，充分混匀后避光反应2 h，于760 nm 测定吸光度。

1.3.4 可溶性醌含量的测定[16]取1.3.3 节的提取液于437nm 测定吸光度。

1.3.5 还原型抗坏血酸含量的测定 采用2，6-二氯靛酚钠法[17]。

1.3.6 多酚氧化酶（PPO）的测定 参考曹建康[18]的方法。10 g 样品中加入5 mL 提取缓冲液，摇匀后，在4 ℃下离心10 min，取上清液200 μL 加入3 mL 0.2 mol/L 邻苯二酚缓冲液，于420 nm 测吸光度变化。以每千克样品每分钟吸光度变化值增加1 为1 个活性单位。

1.3.7 模拟体系的建立 根据He qiang[19]的方法建立模拟体系：将酚类底物表儿茶素溶液0.1 mol/L、多酚氧化酶酶液0.5 mg/L 各1 mL 加入10 mL 试管中，再往10 mL 试管中分别加入质量分数10%的曲酸、抗坏血酸、柠檬酸1 mL，最后用7 mL pH 5.5 的0.1 mol/L 的乙酸-乙酸钠缓冲液定容。以不含有机酸、不含底物的模拟体系作为对照组。空白组以蒸馏水代替有机酸。模拟体系配置完毕后放在4 ℃冰箱内避光保存，于420 nm 处测吸光度并记录相应数值。

1.4 数据统计分析

试验各处理均重复3 次，求其平均值和标准差，结果用x±s 表示。用SPSS 软件进行方差分析及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同有机酸对鲜切苹果硬度的影响

由图1可知，4 种处理对鲜切苹果硬度影响差异不显著（P＞0.05）。用不同有机酸对鲜切苹果进行处理，发现在处理后一天的时间范围内每一组果肉硬度下降明显，但随着时间的逐渐推移，各组果肉硬度在10N 左右浮动，处在一个相对稳定的水平，而经过有机酸浸泡处理的样品的硬度高于经过蒸馏水浸泡处理的样品。说明3 种有机酸浸泡对鲜切苹果质构的影响不大。

2.2 不同有机酸对鲜切苹果褐变指数的影响

鲜切苹果的酶促褐变主要发生在暴露的果肉组织处，多酚氧化酶（PPO）在氧气的存在下将多酚化合物催化为醌，无色的醌类物质由于其化学结构的不稳定性进一步聚合转化为黑色素[20]。由图2可以看出在整个储藏阶段，褐变指数BI 逐渐上升。褐变指数BI 的上升是褐变发生的信号[21]。经曲酸处理的样品的褐变指数BI 上升缓慢，与抗坏血酸、柠檬酸差异性非常显著（P＜0.01）。而柠檬酸处理的样品褐变较快，其BI 值高于对照组。Chen 等[22]发现在5 ℃储藏后期，鲜切苹果经过柠檬酸处理比未经处理的样品更容易褐变。Amodio M L 等[23]使用1%，2%的柠檬酸处理洋蓟时，发现经柠檬酸处理的洋蓟相比于对照组有更低的L*值，更高的a*值。总的来看，曲酸和抗坏血酸能抑制鲜切苹果褐变，而柠檬酸无抑制褐变的效果。

2.3 不同有机酸对鲜切苹果总酚的影响

多酚已被证明具有抗氧化能力并且可以抑制炎症，从而抑制代谢综合征，包括胰岛素抵抗，血脂异常，脂肪肝[24]。苹果中主要的酚类化合物可以分为黄酮苷（类黄酮、槲皮素以及槲皮素化合物）、儿茶素和表型儿茶素、花青素、二氢查耳酮（根皮素和根皮苷）、酚酸（没食子酸和绿原酸）以及原花青素六大类[25]。由图3可知，在第0 天，总酚含量在6 260 mg/kg，在0.5～1 d 内，鲜切苹果中总酚含量下降明显。经过曲酸处理的样品在1～7 d 的时间范围内仍能维持在5 750 mg/kg 左右。而经过抗坏血酸以及柠檬酸处理的样品至第一天以后降至4 500 mg/kg，经过蒸馏水处理的鲜切苹果在第1天以后维持在5 150 mg/kg，可见经过柠檬酸以及抗坏血酸处理的鲜切苹果的总酚含量明显低于曲酸处理的样品，甚至低于蒸馏水处理的样品。原因可能是由于曲酸是酚类物质的结构类似物，其产生的竞争性抑制作用会防止酚类物质被氧化[26]。因此，曲酸在维持鲜切苹果多酚含量方面效果最好。

2.4 不同有机酸对鲜切苹果可溶性醌含量的影响

醌是多酚氧化酶（PPO）和酚类物质在酶促褐变反应过程中的氧化产物。醌的累积通常意味着果蔬中黑色素的形成。Hui Gao 等[15]研究2，4-表油菜素内酯对鲜切藕片酶促褐变影响时发现，对照组可溶性醌的含量是经过2，4-表油菜素内酯处理的1.5 倍，而且可溶性醌与L*值呈负相关，与a*值和b*呈正相关。可见可溶性醌也可以作为褐变的一个间接观察指标。从图4中可以看出经过曲酸处理的样品0～1 d 可溶性醌含量急剧升高，第一天以后吸光度值稳定在0.09 处。经过抗坏血酸处理的样品其可溶性醌含量在0～5 d 一直维持在较低的状态，第5 天之后急剧上升。经柠檬酸和水处理的样品其可溶性醌含量则一直处于上升的趋势，但经过水处理的样品可溶性醌含量高于柠檬酸处理的样品。可见，3 种有机酸均在一定程度上抑制了鲜切苹果褐变。

图1 不同有机酸对鲜切苹果硬度的影响Fig.1 Effect of different organic acid on hardness of fresh-cut apple slices

图2 不同有机酸对鲜切苹果褐变指数的影响Fig.2 Effect of different organic acid on browning index of fresh-cut apple slices

图3 不同有机酸对鲜切苹果总酚的影响Fig.3 Effect of different organic acid on total phenols of fresh-cut apple slices

图4 不同有机酸对鲜切苹果可溶性醌含量的影响Fig.4 Effect of different organic acid on soluble quinone of fresh-cut apple slices

2.5 不同有机酸对鲜切苹果多酚氧化酶的影响

多酚氧化酶的活性部位由两个铜原子构成，其作用机制是基于其氧化酚类化合物的能力。在氧气存在的条件下，多酚氧化酶催化两个不同的反应：一是单酚的羟基化，二是邻苯二酚氧化为邻苯二醌。随后醌经过非酶聚合反应形成黑色素[27]。从图5可以看出，随着储藏天数的增加，多酚氧化酶（PPO）的活性逐渐降低。4 种处理对多酚氧化酶活性影响的差异不显著（P>0.05）。对比3 种有机酸中鲜切苹果中多酚氧化酶的活性发现，抗坏血酸处理的样品酶活最低，蒸馏水浸泡处理的样品在第0.5 天上升到最高值，随后下降很快，曲酸处理的鲜切苹果酶活高于蒸馏水处理的样品，而柠檬酸处理的样品其多酚氧化酶酶活前5 天一直维持在较高的水平，第5 天之后开始下降，这可以解释柠檬酸处理的样品在总酚低的情况下（图3）仍能保持较高的可溶性醌含量（图4），是因为其较高的多酚氧化酶活性。经过曲酸处理的样品其多酚氧化酶活性较强，且其总酚含量很高，然而其可溶性醌的含量并不高，可能是由于曲酸能够将褐色的醌类物质还原成联醌[28]。此外，多酚氧化酶活性越强并不等同于褐变程度越高，因为切块表面多酚氧化酶活性强不代表内部酶活性强，而且酚类化合物的含量和成分也会影响酶活[22]。由图5可以得出，在抑制多酚氧化酶酶活方面，抗坏血酸的抑制能力优于曲酸和柠檬酸。

图5 不同有机酸对鲜切苹果多酚氧化酶的影响Fig.5 Effect of different organic acid on polyphenol oxidase activity of fresh-cut apple slices

图6 不同有机酸对多酚氧化酶酶活的影响Fig.6 Effect of different organic acid on polyphenol oxidase activity

通过模拟体系的试验，在图5中可以发现0～0.5 d 区间的鲜切苹果中酶活大小为蒸馏水>柠檬酸>曲酸>抗坏血酸。富士苹果褐变主要与表儿茶素氧化有关[29]，故按照一致的比例，以表儿茶素为底物，比较不同有机酸对纯酶的作用，并在420 nm 处观察吸光度（图6），可以看出，在不加有机酸的时候，由于酶的作用，吸光值不断升高，于20 min 处达到平衡状态，当体系中加入占总体系1%的有机酸时，可以发现，在同一浓度的3 种有机酸中，抗坏血酸对多酚氧化酶的抑制作用明显强于其它两种酸，抑制作用为抗坏血酸＞曲酸＞柠檬酸＞蒸馏水，与上述（图5）中前0.5 天的结果一致。Qiang He 等[19]通过模拟体系，以绿原酸为底物，研究0～3 mmol/L 浓度的次氯酸对酪氨酸酶的影响，发现浓度越高对酶的抑制作用越强。根据此次模拟，可以得出，在鲜切苹果储藏初期，抗坏血酸的防褐变效果最好。

2.6 不同有机酸对鲜切苹果还原型抗坏血酸含量的影响

维生素C（简称VC），包括抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，是植物性食物中的一种重要的维生素，在食品加工过程中容易降解[30]。根据表2可以看出，随着存储天数的增加，4 种处理样品VC 的含量均逐渐降低。在0.5～9 d 的处藏阶段，曲酸和柠檬酸处理样的VC 含量高于对照组，且经曲酸处理的鲜切苹果的VC 含量高于柠檬酸处理的样品，但差异不显著（P＞0.05）。李庆鹏等[31]采用2.5%的曲酸浸泡处理鲜切西兰花，发现曲酸处理的VC 含量明显高于对照组，在第12 天是对照组的1.65倍。可见曲酸和柠檬酸能较为有效地抑制鲜切苹果VC 的降解。

表1 鲜切苹果的VC 含量的变化（mg/100g）Table 1 Ascorbic acid changes of fresh cut apple during storage （mg/100g）

3 结论

经过曲酸、抗坏血酸以及柠檬酸这3 种有机酸浸泡处理的鲜切苹果，在硬度以及多酚氧化酶活性与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。曲酸在抑制鲜切苹果切块表面褐变，总酚含量方面效果显著优于抗坏血酸、柠檬酸。在维持鲜切苹果还原型抗坏血酸含量方面，曲酸作用效果优于柠檬酸，这两种有机酸的作用效果都显著高于对照组（P＜0.05）。在短时间抑制多酚氧化酶方面，1%的抗坏血酸在储藏初期效果最好（P＜0.05）。

综合分析，3 种有机酸均对鲜切苹果褐变有一定的抑制效果，曲酸在抑制鲜切苹果褐变方面效果最佳，是一种具有潜力的鲜切苹果护色保鲜剂。但是，曲酸对鲜切苹果保鲜效果仍然有待于进一步研究，曲酸抑制苹果褐变的机理还值得深入探讨。